大豆黃酮誘導(dǎo)合成的分子機(jī)理及轉(zhuǎn)錄因子GmMYB100的功能鑒定.pdf

1、黃酮類物質(zhì)是植物次生代謝產(chǎn)物，具有多重生理功能和藥用價(jià)值。大豆黃酮由大豆黃酮合成酶（編碼基因?yàn)榇蠖裹S酮合成酶基因 GmFNSIIs，包括 GmFNSII-1和GmFNSII-2），催化大豆黃烷酮而合成。正常條件下，大豆黃酮含量較低，其生物合成與植物抗逆有關(guān)。與大豆黃酮生物合成相關(guān)的代謝途徑基因已經(jīng)克隆得到，而誘導(dǎo)及調(diào)控其生物合成的分子機(jī)理有待進(jìn)一步深入研究。
　　本研究結(jié)果表明茉莉酸甲酯，甘露醇，葡萄糖和氯化鈉均能誘導(dǎo)大豆黃酮合成

2、酶基因表達(dá)和黃酮在大豆根、莖和葉中產(chǎn)生。克隆大豆黃酮合成酶基因啟動(dòng)子，連接GUS基因，轉(zhuǎn)化大豆毛狀根獲得組合苗，在以上四種處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)基因毛狀根中β-葡萄糖醛酸酶（GUS）活性均有不同程度顯著提高，其中連接基因 GmFNSII-1啟動(dòng)子（proGmFNSII-1）的GUS活性受茉莉酸甲酯誘導(dǎo)上調(diào)幅度最大，而甘露醇能顯著誘導(dǎo)基因GmFNSII-1和GmFNSII-2兩個(gè)啟動(dòng)子（proGmFNSII-1和proGmFNSII-2）活性。啟

3、動(dòng)子proGmFNSII-1和proGmFNSII-2序列上存在與脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，啟動(dòng)子5’端缺失分析發(fā)現(xiàn)，茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（CGTCA）突變后降低了啟動(dòng)子proGmFNSII-1對(duì)茉莉酸甲酯的響應(yīng)效果；滲透脅迫響應(yīng)區(qū)段的存在和糖抑制響應(yīng)序列的缺失均有助于啟動(dòng)子proGmFNSII-2對(duì)葡萄糖響應(yīng)，表明葡萄糖作為滲透因子（正調(diào)控）和糖信號(hào)分子（負(fù)調(diào)控）誘導(dǎo)基因GmFNSII-2表達(dá)?；騁mFNSIIs的mRNA表達(dá)及黃酮

4、合成在大豆 GmFNSIIs-RNAi轉(zhuǎn)化根中受到抑制；氯化鈉脅迫處理3天后，GmFNSIIs-RNAi組合苗相比對(duì)照，轉(zhuǎn)化毛狀根中丙二醛和過氧化氫類物質(zhì)含量顯著增加，脅迫2周后組合苗生物量顯著降低，表明GmFNSIIs表達(dá)及黃酮含量影響大豆氯化鈉脅迫抗性。
　　大豆轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO分析得到123個(gè)與苯丙氨酸代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。茉莉酸甲酯處理大豆幼苗24小時(shí)后，對(duì)123個(gè)基因的表達(dá)譜研究發(fā)現(xiàn)，葉中63個(gè)基因表達(dá)量上調(diào)（51％

5、），14個(gè)下調(diào)（11%）；根中84個(gè)基因表達(dá)提升（68%），6個(gè)下降（5%），其中在根葉中有44個(gè)基因同時(shí)發(fā)生顯著變化。分析44個(gè)基因在其他處理（水楊酸，蔗糖和大豆根瘤菌USDA110）的大豆根中表達(dá)情況，從中選出表達(dá)差異顯著的14個(gè)基因，成功克隆到其中8個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。酵母單雜交分析發(fā)現(xiàn)，四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（TF54，TF62，TF88和TF100）具有轉(zhuǎn)錄激活活性?；騁mMYB100（TF100）編碼 R2R3_MYB轉(zhuǎn)錄因子，原核表達(dá)得到

6、蛋白大小和預(yù)測(cè)一致（26.16 kDa）。GmMYB100轉(zhuǎn)錄因子R3結(jié)構(gòu)域上存在保守氨基酸基序[D/E]LX2[R/K]X3LX6LX3R，參與 MYB轉(zhuǎn)錄因子和 bHLH蛋白之間的互作，在 C端存在保守性氨基酸基序pdLNLD/EL（與植物黃酮類物質(zhì)生物合成負(fù)調(diào)控相關(guān)），推斷GmMYB100與植物類黃酮負(fù)調(diào)控相關(guān)。基因GmMYB100在大豆葉片，花及幼胚發(fā)育早期表達(dá)量高，其蛋白具有轉(zhuǎn)錄激活活性，定位在細(xì)胞核中。在 GmMYB100-

7、OE轉(zhuǎn)基因大豆毛狀根中，部分大豆黃酮合成相關(guān)基因（GmCHS7，GmCHS8，GmCHI，GmIFS1和 GmF3H）的表達(dá)量相比對(duì)照顯著降低，大豆異黃酮含量降低，而大豆黃酮含量沒有顯著變化。而GmMYB100-RNAi的轉(zhuǎn)基因大豆毛狀根中，部分大豆黃酮合成相關(guān)基因（GmCHS7，GmCHS8，GmCHI，GmFNSII-1和GmF3H）的表達(dá)量相比對(duì)照升高，大豆異黃酮和大豆黃酮含量顯著提升。在轉(zhuǎn)基因擬南芥 GmMYB100-OE中，擬

8、南芥黃酮醇合成部分相關(guān)基因（AtCHS，AtCHI，AtF3’H，AtF3H，AtDFR2和AtFLS）的表達(dá)量相比對(duì)照都顯著下降，轉(zhuǎn)基因擬南芥中黃酮醇含量顯著降低。煙草瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，基因GmMYB100過量表達(dá)抑制大豆黃酮合成相關(guān)基因GmCHS7和GmCHI啟動(dòng)子活性，但是激活GmF3H，GmFNSII-1和GmANS基因啟動(dòng)子，表明基因GmMYB100負(fù)調(diào)控部分黃酮合成相關(guān)基因的啟動(dòng)子。本研究證實(shí)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子GmMY

9、B100負(fù)調(diào)控黃酮合成相關(guān)基因的表達(dá)。
　　綜上所述，在大豆黃酮受脅迫誘導(dǎo)生物合成過程中，大豆黃酮合成酶基因啟動(dòng)子 proGmFNSII-1上順式元件（CGTCA）響應(yīng)茉莉酸甲酯的誘導(dǎo)，啟動(dòng)子proGmFNSII-2順式元件影響了葡萄糖對(duì)黃酮合成誘導(dǎo)時(shí)產(chǎn)生滲透作用和糖信號(hào)因子兩個(gè)作用。大豆黃酮含量和耐鹽性相關(guān)，對(duì)于改善大豆耐鹽性方面具有重要作用。同時(shí)鑒定到轉(zhuǎn)錄因子GmMYB100，其負(fù)調(diào)控大豆黃酮合成相關(guān)基因表達(dá)，影響黃酮生物合成