大豆疫霉bZIP轉(zhuǎn)錄因子PsBZPl的功能研究.pdf

1、大豆疫霉屬于卵菌門，在親緣關(guān)系上與真菌相差甚遠(yuǎn)而與褐藻和硅藻比較接近。由于大豆疫霉在生物學(xué)特征以及發(fā)病機(jī)制等方面與真菌差異較大，所以多數(shù)殺真菌劑對(duì)其沒有效果。此外，大豆疫霉基因組不穩(wěn)定，容易發(fā)生基因突變，導(dǎo)致它能夠較快地對(duì)殺菌劑產(chǎn)生抗藥性，也能迅速克服寄主植物的抗病性。大豆疫霉等4種疫霉菌全基因組序列的公布和疫霉菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立，為我們從分子水平上了解疫霉菌的致病機(jī)理并且尋找廣譜高效的疫霉菌殺菌劑提供了良好的平臺(tái)。本研究充分發(fā)揮生物

2、信息學(xué)技術(shù)優(yōu)勢(shì)，通過對(duì)大豆疫霉中一個(gè)與致病性相關(guān)的MAPK PsSAK1沉默突變體的DGE表達(dá)譜分析，篩選到一批可能受PsSAK1調(diào)控的候選基因。選取3個(gè)bZIP轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)合PEG介導(dǎo)的大豆疫霉瞬時(shí)沉默體系得到沉默突變體后研究大豆疫霉bZIP轉(zhuǎn)錄因子的基因功能，為了解大豆疫霉分子致病機(jī)理提供了參考。
　　 轉(zhuǎn)錄因子是直接調(diào)控基因表達(dá)和應(yīng)答特定信號(hào)途徑的關(guān)鍵因子，研究大豆疫霉轉(zhuǎn)錄因子能找到直接調(diào)控大豆疫霉致病性相關(guān)的生物學(xué)過程的

3、關(guān)鍵基因。通過生物信息學(xué)分析，我們?cè)诖蠖挂呙够蚪M中預(yù)測(cè)了17個(gè)bZIP轉(zhuǎn)錄因子，其編碼的蛋白長(zhǎng)度從168到1042個(gè)氨基酸不等。該家族成員序列之間相似性低，并且在基因組上分布分散，只有Ps128339和Ps128400成簇排列于scaffold4。通過在線工具M(jìn)EME，我們預(yù)測(cè)了大豆疫霉bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族5種可能的功能域，其中motif1存在于所有大豆疫霉bZIP轉(zhuǎn)錄因子中且具有bZIP轉(zhuǎn)錄因子連續(xù)亮氨酸間隔排列的特征序列。根據(jù)轉(zhuǎn)錄

4、模式的不同我們將bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族分為5類，大多數(shù)成員在游動(dòng)孢子、休止孢、休止孢萌發(fā)以及侵染階段上調(diào)表達(dá)，根據(jù)上述差異表達(dá)基因推測(cè)大豆疫霉bZIP轉(zhuǎn)錄因子與大豆疫霉游動(dòng)孢子和休止孢的發(fā)育過程以及致病過程相關(guān)。本章生物信息學(xué)分析為后續(xù)bZIP轉(zhuǎn)錄因子功能研究提供了依據(jù)。
　　 PsSAK1是一個(gè)與游動(dòng)孢子活力及致病性相關(guān)的MAPK，為找到可能在下游受其調(diào)控的作用元件，在第一章生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，本章研究挑選了3個(gè)在PsSAK

5、1沉默突變體休止孢萌發(fā)階段以及侵染早期均下調(diào)的大豆疫霉bZIP轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行具體的功能分析，其中PsBZP1全長(zhǎng)1622 bp，含有5個(gè)內(nèi)含子，編碼的蛋白含413個(gè)氨基酸，qRT-PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)該基因在大豆疫霉游動(dòng)孢子、休止孢以及休止孢萌發(fā)階段均上調(diào)表達(dá)。通過大豆疫霉瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系將其沉默，得到2個(gè)沉默效率分別為70％和60％的突變體。通過表型分析發(fā)現(xiàn)，PsBZP1的沉默不影響游動(dòng)孢子趨化性和菌絲生長(zhǎng)速率，但對(duì)游動(dòng)孢子的游動(dòng)性及活力有嚴(yán)重影

6、響。PsBZP1沉默突變體游動(dòng)孢子不能正常螺旋式前進(jìn)而原地轉(zhuǎn)圈游動(dòng)，游動(dòng)異常比率為39.3％。PsBZP1沉默突變體和野生型在2小時(shí)后的平均休止率分別為27.5％和19％，平均萌發(fā)率分別為78％和54％，均顯著提高。PsBZP1沉默突變體休止孢萌發(fā)的芽管畸形，芽管頂端短粗卷曲出現(xiàn)畸形分支，休止孢萌發(fā)的畸形率為72.3％。此外，PsBZP1沉默突變體侵染大豆感病寄主的葉片和黃化苗下胚軸時(shí)出現(xiàn)明顯的褐色壞死斑，致病性降低。上述結(jié)果表明，Ps