大豆疫霉侵染過程的分子細(xì)胞學(xué)研究.pdf

1、大豆疫霉（Phytophthora sojae Kaufmann&Gerdemann）引起的大豆（Glycine max）根腐病是大豆生產(chǎn)上極其嚴(yán)重的病害之一;全世界每年因根腐病引起的經(jīng)濟(jì)損失可高達(dá)10億美元以上。大豆疫霉為大豆的專性病原菌，田間初侵染源為通過有性生殖過程發(fā)育而來的卵孢子;卵孢子在適宜的環(huán)境下形成游動(dòng)孢子囊，并通過孢子裘內(nèi)原生質(zhì)體的割裂形成初始接種體游動(dòng)孢子對寄主進(jìn)行侵染。對大豆疫霉侵染過程以及與寄主互作的細(xì)胞學(xué)研究，不

2、僅能夠促進(jìn)對疫霉菌致病機(jī)理的了解，還能推動(dòng)與致病過程相關(guān)分子生物學(xué)的研究，為認(rèn)識和掌握該病害發(fā)生、流行規(guī)律以及制訂有效的防治策略提供理論依據(jù)。本文采用常規(guī)的細(xì)胞學(xué)染色方法和分子熒光探針對大豆疫霉與感病寄主的侵染互作過程進(jìn)行了較為系統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)研究;并通過綠色熒光蛋白(GreenFluorescent Protein，GFP)標(biāo)記菌株的獲得，揭示大豆疫霉與寄主親和、非親和互作的動(dòng)態(tài)變化過程。
　　 大豆疫霉與寄主親和互作過程的細(xì)胞學(xué)

3、研究。根據(jù)大豆疫霉形態(tài)特征的變化，將其侵染過程分為3個(gè)主要階段，即侵染前期、侵入階段和侵入后擴(kuò)展階段。侵染前期，即大豆疫霉的無性生活史階段，菌絲體通過在體內(nèi)原生質(zhì)往頂端地流動(dòng)聚集，逐漸膨大發(fā)育形成無性生殖結(jié)構(gòu)游動(dòng)孢子囊;并通過對游動(dòng)孢子囊內(nèi)的原生質(zhì)體的割裂形成初始侵染體游動(dòng)孢子。侵入階段，游動(dòng)孢子通過游動(dòng)尋找的到適合寄主后，隨即在寄主表皮細(xì)胞間休止、附著，并通過萌發(fā)形成的芽管在寄主表面尋找適合侵入位點(diǎn)。約接種后3h，絕大多數(shù)萌發(fā)的休止孢

4、并沒有在芽管頂端形成明顯的附著胞結(jié)構(gòu)，而是以芽管為侵入結(jié)構(gòu)在表皮細(xì)胞間隙處直接穿透寄主。侵入后擴(kuò)展階段，絕大多數(shù)休止孢在接種后6h已成功侵入寄主;初始侵入菌絲主要在寄主體內(nèi)細(xì)胞間的空隙進(jìn)行延伸擴(kuò)展，同時(shí)菌絲兩側(cè)開始形成圓盤狀的吸器結(jié)構(gòu)。接種后約20 h，侵染菌絲已擴(kuò)展到下胚軸髓部（木質(zhì)部），充滿整個(gè)組織細(xì)胞，并開始向表皮外擴(kuò)展生長。苯胺藍(lán)和DAB的顯色標(biāo)記表明，侵入位點(diǎn)周圍的寄主細(xì)胞產(chǎn)生了顯著的胼胝質(zhì)積累，活性氧(ROS)迸發(fā)、以及過氧

5、化物酶的聚集分布。
　　 大豆疫霉綠色熒光蛋白標(biāo)記菌株的遺傳穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。利用GFP標(biāo)記對侵染過程進(jìn)行示蹤，是目前研究植物病原菌與寄主互作的最為有效的細(xì)胞學(xué)方法之一。本研究對卵菌遺傳穩(wěn)定轉(zhuǎn)化載體pTOR和pHAM34進(jìn)行改造，成功構(gòu)建了能夠在大豆疫霉中穩(wěn)定表達(dá)含有GFP標(biāo)記基因的pTOR::GFP和pHAM34::Flag-GFP載體，包括在pHAM34::Flag-GFP載體中引入了多個(gè)酶切位點(diǎn)，為今后通過GFP報(bào)告系統(tǒng)研究目的基

6、因的功能與定位，以及示蹤等提供可能。通過CaCl2-PEG介導(dǎo)的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，獲得了以pTOR::GFP為導(dǎo)入載體的大豆疫霉GFP熒光菌株。對3個(gè)GFP標(biāo)記菌株的菌落形態(tài)與直徑、游動(dòng)孢子囊形成、休止孢萌發(fā)、卵孢子形成，以及致病性等生物學(xué)性狀進(jìn)行測定，結(jié)果表明，GFP的插入表達(dá)對大豆疫霉的營養(yǎng)生長、發(fā)育過程以及與致病力沒有影響。因此，GFP標(biāo)記菌株完全可以用于研究大豆疫霉與寄主的互作過程。
　　 綠色熒光蛋白標(biāo)記菌株與寄主親和

7、及非親和互作過程的細(xì)胞學(xué)研究。GFP標(biāo)記顯示，大豆疫霉在穿透寄主后，侵染菌絲通過分化形成乳突狀的吸器結(jié)構(gòu)與寄主體內(nèi)細(xì)胞保持“親密接觸”;接種后約12小時(shí)，侵染菌絲即可到達(dá)感病品種Williams下胚軸的木質(zhì)部（髓部），并逐漸開始在寄主體內(nèi)形成各種形態(tài)的菌絲膨大結(jié)構(gòu)，有瘤狀、菌索狀、笤帚以及肺葉狀等。而在與抗病寄主PRX146-36的非親和互作中，侵染菌絲不僅主要局限于下胚軸的外皮層，幾乎不能擴(kuò)展至內(nèi)皮層，并且還引發(fā)受侵染部位細(xì)胞組織產(chǎn)生