大豆疫霉侵染過程的分子細胞學(xué)研究.pdf

1、大豆疫霉（Phytophthora sojae Kaufmann&Gerdemann）引起的大豆（Glycine max）根腐病是大豆生產(chǎn)上極其嚴重的病害之一;全世界每年因根腐病引起的經(jīng)濟損失可高達10億美元以上。大豆疫霉為大豆的專性病原菌，田間初侵染源為通過有性生殖過程發(fā)育而來的卵孢子;卵孢子在適宜的環(huán)境下形成游動孢子囊，并通過孢子裘內(nèi)原生質(zhì)體的割裂形成初始接種體游動孢子對寄主進行侵染。對大豆疫霉侵染過程以及與寄主互作的細胞學(xué)研究，不

2、僅能夠促進對疫霉菌致病機理的了解，還能推動與致病過程相關(guān)分子生物學(xué)的研究，為認識和掌握該病害發(fā)生、流行規(guī)律以及制訂有效的防治策略提供理論依據(jù)。本文采用常規(guī)的細胞學(xué)染色方法和分子熒光探針對大豆疫霉與感病寄主的侵染互作過程進行了較為系統(tǒng)的細胞學(xué)研究;并通過綠色熒光蛋白(GreenFluorescent Protein，GFP)標記菌株的獲得，揭示大豆疫霉與寄主親和、非親和互作的動態(tài)變化過程。
　　 大豆疫霉與寄主親和互作過程的細胞學(xué)

3、研究。根據(jù)大豆疫霉形態(tài)特征的變化，將其侵染過程分為3個主要階段，即侵染前期、侵入階段和侵入后擴展階段。侵染前期，即大豆疫霉的無性生活史階段，菌絲體通過在體內(nèi)原生質(zhì)往頂端地流動聚集，逐漸膨大發(fā)育形成無性生殖結(jié)構(gòu)游動孢子囊;并通過對游動孢子囊內(nèi)的原生質(zhì)體的割裂形成初始侵染體游動孢子。侵入階段，游動孢子通過游動尋找的到適合寄主后，隨即在寄主表皮細胞間休止、附著，并通過萌發(fā)形成的芽管在寄主表面尋找適合侵入位點。約接種后3h，絕大多數(shù)萌發(fā)的休止孢

4、并沒有在芽管頂端形成明顯的附著胞結(jié)構(gòu)，而是以芽管為侵入結(jié)構(gòu)在表皮細胞間隙處直接穿透寄主。侵入后擴展階段，絕大多數(shù)休止孢在接種后6h已成功侵入寄主;初始侵入菌絲主要在寄主體內(nèi)細胞間的空隙進行延伸擴展，同時菌絲兩側(cè)開始形成圓盤狀的吸器結(jié)構(gòu)。接種后約20 h，侵染菌絲已擴展到下胚軸髓部（木質(zhì)部），充滿整個組織細胞，并開始向表皮外擴展生長。苯胺藍和DAB的顯色標記表明，侵入位點周圍的寄主細胞產(chǎn)生了顯著的胼胝質(zhì)積累，活性氧(ROS)迸發(fā)、以及過氧

5、化物酶的聚集分布。
　　 大豆疫霉綠色熒光蛋白標記菌株的遺傳穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。利用GFP標記對侵染過程進行示蹤，是目前研究植物病原菌與寄主互作的最為有效的細胞學(xué)方法之一。本研究對卵菌遺傳穩(wěn)定轉(zhuǎn)化載體pTOR和pHAM34進行改造，成功構(gòu)建了能夠在大豆疫霉中穩(wěn)定表達含有GFP標記基因的pTOR::GFP和pHAM34::Flag-GFP載體，包括在pHAM34::Flag-GFP載體中引入了多個酶切位點，為今后通過GFP報告系統(tǒng)研究目的基

6、因的功能與定位，以及示蹤等提供可能。通過CaCl2-PEG介導(dǎo)的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，獲得了以pTOR::GFP為導(dǎo)入載體的大豆疫霉GFP熒光菌株。對3個GFP標記菌株的菌落形態(tài)與直徑、游動孢子囊形成、休止孢萌發(fā)、卵孢子形成，以及致病性等生物學(xué)性狀進行測定，結(jié)果表明，GFP的插入表達對大豆疫霉的營養(yǎng)生長、發(fā)育過程以及與致病力沒有影響。因此，GFP標記菌株完全可以用于研究大豆疫霉與寄主的互作過程。
　　 綠色熒光蛋白標記菌株與寄主親和

7、及非親和互作過程的細胞學(xué)研究。GFP標記顯示，大豆疫霉在穿透寄主后，侵染菌絲通過分化形成乳突狀的吸器結(jié)構(gòu)與寄主體內(nèi)細胞保持“親密接觸”;接種后約12小時，侵染菌絲即可到達感病品種Williams下胚軸的木質(zhì)部（髓部），并逐漸開始在寄主體內(nèi)形成各種形態(tài)的菌絲膨大結(jié)構(gòu)，有瘤狀、菌索狀、笤帚以及肺葉狀等。而在與抗病寄主PRX146-36的非親和互作中，侵染菌絲不僅主要局限于下胚軸的外皮層，幾乎不能擴展至內(nèi)皮層，并且還引發(fā)受侵染部位細胞組織產(chǎn)生