大豆疫霉Ras GTPase蛋白PsARF1的功能研究.pdf

1、大豆是世界上重要的經(jīng)濟作物之一，大豆疫霉（Phytophthorasojae）能夠侵染大豆引起幼苗猝倒和成株的根腐病，給世界的大豆產(chǎn)業(yè)帶來了巨額的經(jīng)濟損失。該菌的無性生活史對于病害在大田里迅速流行起著重要的作用，隨著大豆疫霉全基因組測序的完成，研究者可以在分子水平上對基因的轉(zhuǎn)錄模式進行研究分析，為完善人們對大豆疫霉分子致病機制的了解提供了新的研究方法。大豆疫霉在侵染植物的過程中會產(chǎn)生大量的效應(yīng)分子來破壞植物的抗病性，而植物則會通過抗病基

2、因識別這些效應(yīng)分子做出反應(yīng)，明確這些效應(yīng)分子從大豆疫霉細胞內(nèi)到細胞外的分泌途徑十分重要。囊泡運輸是細胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運的一種基本運輸方式,想據(jù)其衣被蛋白的不同分為COPⅠ、COPⅡ和網(wǎng)格蛋白衣被囊泡三種，COPⅠ衣被囊泡主要負責(zé)高爾基體到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的物質(zhì)運輸。ARF1是小G蛋白Ras家族的成員，它是COPⅠ衣被囊泡形成所不可缺少的，也是膜轉(zhuǎn)運過程的重要調(diào)控因子。
　　本文利用生物信息學(xué)方法在大豆疫霉基因組中預(yù)測到了編碼ARF1的基因，通過分

3、析發(fā)現(xiàn)該基因在進化過程中是高度保守的。對這個基因在大豆疫霉5個無性發(fā)育階段和5個侵染階段的表達水平進行了分析，發(fā)現(xiàn)它在這十個階段都有表達，但在侵染階段具有較高的轉(zhuǎn)錄水平，該結(jié)果說明PsARF1在大豆疫霉侵染過程中發(fā)揮了重要作用。
　　本研究通過PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法在大豆疫霉菌P6497(race2)中對PsARF1進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，篩選到3個沉默突變體。用沉默突變體接種大豆黃化苗下胚軸可觀察到突變體致病能力明顯減弱，且病斑在創(chuàng)

4、傷和非創(chuàng)傷大豆黃化苗下胚軸上的擴展能力都受到一定的抑制，通過顯微觀察證實沉默突變體菌絲穿透黃化苗表皮層的能力和在細胞間擴展的能力較野生型明顯減弱，說明PsARF1在大豆疫霉侵染寄主的過程中發(fā)揮了重要作用。通過對沉默突變體的表型分析發(fā)現(xiàn)PsARF1的沉默會影響菌落的生長速率及休止孢的萌發(fā)，但并不會影響其細胞壁的完整性。進一步的實驗觀察發(fā)現(xiàn)沉默突變體清除過氧化氫及胼胝質(zhì)的能力明顯減弱，說明PsARF1的沉默能影響大豆疫霉對植物基礎(chǔ)防衛(wèi)反應(yīng)的