大豆疫霉G蛋白α亞基調(diào)控游動孢子趨化性的機(jī)制研究.pdf

1、大豆疫霉(Phytophthora sojae)侵染大豆引起的根腐病是大豆生產(chǎn)上的毀滅性病害之一。大豆疫霉的游動孢子釋放后，可以特異地識別寄主分泌的異黃酮類物質(zhì)，通過趨化性尋找寄主并啟動侵染過程。因此趨化性是大豆疫霉完成侵染循環(huán)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。解釋疫霉菌趨化性的分子機(jī)理對尋找新的殺菌劑靶標(biāo)具有重要價值。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)PsGPA1編碼的G蛋白α亞基參與調(diào)控游動孢子趨化性，但對其下游信號通路的了解還非常有限。因此，本研究綜合利用親和純化、

2、質(zhì)譜鑒定及基因沉默等技術(shù)對大豆疫霉G蛋白α亞基調(diào)控游動孢子趨化性的機(jī)制進(jìn)行了探索，鑒定到了一系列潛在的PsGPA1互作蛋白，并利用基因沉默的方法針對其中PsHint1的功能進(jìn)行了研究。
　　PsGPA1互作蛋白的篩選與鑒定:為了分析PsGPA1介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及分子機(jī)制，本研究對PsGPA1的互作蛋白進(jìn)行了篩選。本文在大豆疫霉中成功表達(dá)了融合FLAG標(biāo)簽的PsGPA1，并利用親和純化的方法來篩選大豆疫霉中與PsGPA1物理互作的

3、蛋白。通過質(zhì)譜分析，鑒定到了一系列候選蛋白，如HIT核苷酸結(jié)合蛋白PsHint1和谷氧還蛋白PsGrx1，并分別對其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行了分析。隨后成功在原核中對候選蛋白及PsGPA1進(jìn)行了表達(dá)，并利用GST pull-down的方法對親和純化的結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了PsHint1與PsGPA1的互作關(guān)系，但PsGrx1與空載體對照也存在互作，因此PsGrx1與PsGPA1的互作關(guān)系有待進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　PsPGA1的互作蛋白Ps

4、Hint1參與調(diào)控大豆疫霉的趨化性及致病性:在前文中鑒定到了一個PsGPA1的互作蛋白，PsHint1。其具有一個HIT結(jié)構(gòu)域，且為人類HINT1的同源蛋白。為了對蛋白間的體內(nèi)互作進(jìn)行分析從而驗(yàn)證前一章的結(jié)果，本研究建立了疫霉蛋白共表達(dá)體系，成功構(gòu)建了PsHint1與PsGPA1的共表達(dá)載體并進(jìn)行了大豆疫霉轉(zhuǎn)化，隨后的co-IP實(shí)驗(yàn)證實(shí)了PsHint1與PsGPA1的互作。本研究同時利用體外GST pull-down的方法對二者的關(guān)系進(jìn)

5、行了驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PsHint1與GTP或GDP結(jié)合狀態(tài)下的PsGPA1均可以發(fā)生互作。本文對PsHint1的轉(zhuǎn)錄模式、亞細(xì)胞定位及生物學(xué)功能進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，PsHint1在侵染階段上調(diào)表達(dá);其在大豆疫霉細(xì)胞核、細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均檢測到定位。利用基因沉默的方法對PsHint1進(jìn)行功能分析發(fā)現(xiàn)，其參與調(diào)控游動孢子對大豆根毛及異黃酮類物質(zhì)的趨化性。PsHint1沉默轉(zhuǎn)化子的休止孢萌發(fā)異常，產(chǎn)生了高度分枝或末端膨大的芽管。在與大豆

6、感病品種Hefeng47互作過程中，PsHint1的沉默使得轉(zhuǎn)化子對于寄主的致病力顯著減弱，侵入菌絲在大豆表皮細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增受到了顯著抑制，并導(dǎo)致侵染點(diǎn)附近的大豆細(xì)胞出現(xiàn)了壞死反應(yīng)。PsHint1沉默轉(zhuǎn)化子與PsGPA1沉默轉(zhuǎn)化子致病力減弱的原因并不相同。這些結(jié)果說明PsHint1不僅通過與PsGPA1互作來調(diào)控游動孢子趨化性，還參與了一條不依賴Gα的調(diào)控致病性的信號通路。
　　致病相關(guān)蛋白PsHint1參與調(diào)控的下游信號通路分析:

7、為了進(jìn)一步分析PsHint1調(diào)控大豆疫霉致病過程的分子機(jī)制，本文對其沉默轉(zhuǎn)化子致病力減弱的原因進(jìn)行了進(jìn)一步分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)轉(zhuǎn)化子對氧化壓力脅迫的敏感性顯著上升。DAB染色試驗(yàn)表明PsHint1沉默轉(zhuǎn)化子喪失了清除侵染點(diǎn)周圍ROS的能力，而采用NADPH氧化酶抑制劑DPI清除大豆表皮細(xì)胞產(chǎn)生的ROS后，可以部分恢復(fù)PsHint1沉默轉(zhuǎn)化子的侵入菌絲在大豆細(xì)胞中的擴(kuò)展能力。此外，qRT-PCR結(jié)果證實(shí)，PsHint1的沉默導(dǎo)致部分RxLR

8、效應(yīng)分子轉(zhuǎn)錄模式異常。本研究對PsHint1沉默轉(zhuǎn)化子侵染3小時階段的樣品進(jìn)行了RNA-seq分析，所獲得的數(shù)據(jù)與qRT-PCR結(jié)果相符。RNA-seq數(shù)據(jù)顯示，在PsHint1沉默轉(zhuǎn)化子中，大量激發(fā)子類似基因上調(diào)表達(dá)，PsHint1的沉默還影響了部分轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄。由此可以推測，PsHint1可能通過調(diào)控ROS的清除、RxLR效應(yīng)分子的轉(zhuǎn)錄及激發(fā)子類似基因的表達(dá)來作用于大豆疫霉致病過程。本研究利用親和純化的方法對PsHint1的互作蛋

9、白進(jìn)行了篩選，鑒定到了HSP70、AGC蛋白激酶、核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白α及一系列蛋白翻譯相關(guān)蛋白，它們與PsHint1的關(guān)系有待進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　PsGPA1靶標(biāo)蛋白的篩選及功能分析:大豆疫霉中編碼G蛋白α亞基的基因PsGPA1在大豆疫霉趨化性及致病性進(jìn)程中起著關(guān)鍵作用。在前期實(shí)驗(yàn)中，本研究對PsGPA1的互作蛋白進(jìn)行了篩選，但所得到的結(jié)果尚未能解釋PsGPA1行使復(fù)雜功能的分子機(jī)制。因此，本研究對原有的親和純化方法進(jìn)行了優(yōu)化，在大豆疫霉P

10、sGPA1-FLAG轉(zhuǎn)化子的蛋白裂解液中外源添加了GTP抗水解類似物GTPγS，從而人為地使Gα處于激活狀態(tài)，旨在進(jìn)一步尋找PsGPA1的下游靶標(biāo)蛋白。通過該方法我們鑒定到了多個蛋白激酶(PsSNF1和PsYPK2)、一個蛋白磷酸酶(PsPPEF)及一個小G蛋白(PsRABB1)。GST pull-down也進(jìn)一步證實(shí)了以上4個候選蛋白與PsGPA1的互作關(guān)系。對以上候選靶標(biāo)的轉(zhuǎn)錄模式進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，該四個基因均在大豆疫霉侵染階段上調(diào)表

11、達(dá)，暗示了它們可能參與調(diào)控大豆疫霉的致病過程，從而可為后期的基因功能驗(yàn)證提供線索。以上四個候選蛋白的生物學(xué)功能有待進(jìn)一步研究。
　　本研究利用親和純化的方法對PsGPA1的互作蛋白進(jìn)行了鑒定，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了體系優(yōu)化，以期篩選PsGPA1的下游靶標(biāo)蛋白。該實(shí)驗(yàn)體系有望為疫霉菌其它基因的互作蛋白篩選提供重要的參考。本研究在疫霉菌中對G蛋白下游信號通路進(jìn)行了鑒定，并發(fā)現(xiàn)G蛋白α亞基的互作蛋白PsHint1同樣參與調(diào)控游動孢子的趨化性