大豆疫霉無(wú)毒基因基因組結(jié)構(gòu)特征的研究及其應(yīng)用.pdf

1、大豆疫霉(Phytophthora sojae)侵染大豆(Glycine max)引起的疫霉根腐病是威脅全世界大豆生產(chǎn)的毀滅性病害之一，大豆和大豆疫霉的互作符合基因?qū)驅(qū)W說(shuō)，合理利用大豆的抗病基因是控制大豆疫病的最有效的措施，因此，研究大豆的抗性基因和大豆疫霉的無(wú)毒基因在分子水平上的互作機(jī)理是解釋病害發(fā)生機(jī)制和開(kāi)發(fā)病害控制措施的根本途徑。但是，由于疫霉基因組較大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且疫霉遺傳轉(zhuǎn)化體系建立困難重重，疫霉無(wú)毒基因的標(biāo)記和克隆工作進(jìn)

2、展十分緩慢，目前已報(bào)道的疫霉無(wú)毒基因僅有三例.本研究未采用傳統(tǒng)的無(wú)毒基因克隆策略，而是充分發(fā)揮新興的生物信息學(xué)技術(shù)優(yōu)勢(shì)，通過(guò)對(duì)無(wú)毒基因的基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，在國(guó)際上首次發(fā)現(xiàn)了無(wú)毒基因在基因組上呈多拷貝的重要基因組特征，并且利用這一特征迅速篩選到一批候選無(wú)毒基因，結(jié)合大豆疫霉菌的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究手段，從其中克隆了無(wú)毒基因Avr3c，定位了無(wú)毒基因Avr5，為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)大豆疫病的致病分子機(jī)理和開(kāi)發(fā)該病害的防治措施提供了理論和實(shí)踐意義，

3、更重要的是，本研究開(kāi)辟的一套克隆疫霉無(wú)毒基因的全新方法，對(duì)克隆更多的疫霉無(wú)毒基因具有指導(dǎo)作用，對(duì)其它病原物的無(wú)毒基因克隆工作亦具有重要的借鑒和參考價(jià)值。 研究大豆的抗性基因和大豆疫霉的無(wú)毒基因在分子水平上的互作機(jī)理是解釋病害發(fā)生機(jī)制和控制病害發(fā)生的根本方法。綜合利用生物信息學(xué)、測(cè)序、Southern blotting和Real time PCR等技術(shù)對(duì)不同菌株中的Avr3a的基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)Avr3a在含有Avr3

4、a-1序列的無(wú)毒菌株(R2、R1、R3、R8、R9、Rl0、R11、R16和R25)基因組中有4個(gè)完全一致的拷貝，但在含有Avr3a-3序列的無(wú)毒菌株(R12、R19和R20)中卻只有1個(gè)拷貝，在含有Avr3a-2序列的毒性菌株(R6、R7、R17、R21和R24)中也只有1個(gè)拷貝，無(wú)毒菌株R2的4個(gè)Avr3a拷貝并非呈簇狀簡(jiǎn)單的排列在基因組上，而是分別座落在4個(gè)序列幾乎完全一致的10.8 kb重復(fù)片段上，每一個(gè)片段被預(yù)測(cè)含有5個(gè)Ope

5、n Reading Frame(ORF)。Avr3a無(wú)毒片段在橡樹(shù)疫霉(p.ramorum)和致病疫霉(p.infestans)中的劇烈變化，揭示該無(wú)毒片段在進(jìn)化中經(jīng)歷了復(fù)雜的演變。迄今，已克隆的無(wú)毒基因PrAvr3a，PsAvr3a，PsAvrla和PsAvr1b均為在無(wú)毒菌株中存在多拷貝的RXLR基因，針對(duì)該特征，利用depth sampling方法在大豆疫霉全基因組中找到了70個(gè)可能含有多拷貝的RXLR基因，這些基因是大豆疫霉無(wú)毒

6、基因的重要候選基因。以上研究對(duì)進(jìn)一步認(rèn)識(shí)無(wú)毒基因的特征，鑒定和克隆更多的無(wú)毒基因，并最終揭示大豆疫霉的致病分子機(jī)理具有理論和實(shí)踐意義。 對(duì)已克隆的無(wú)毒基因Avrlb，Avrla和Avr3a的研究發(fā)現(xiàn)卵菌無(wú)毒基因可能具有共同的特征：含有信號(hào)肽和RXLR motif，大多座落在基因組的連續(xù)復(fù)制大片段上，同時(shí)大豆疫霉無(wú)毒基因在侵染大豆的24小時(shí)和48小時(shí)中也是有規(guī)律可循的。因此借助depth sampling和Microarray分析

7、手段，本文迅速縮小了無(wú)毒基因的范圍。453個(gè)預(yù)測(cè)含有RXLR motif的ORF被進(jìn)行了depth sampling分析，發(fā)現(xiàn)了70個(gè)trace file value>35(兩個(gè)以上拷貝)的ORF。利用nucroarray技術(shù)對(duì)107個(gè)在affymetrix clups上的RXLR基因的高通量表達(dá)分析，57個(gè)在侵染24h，48h和游動(dòng)孢子萌發(fā)階段高量表達(dá)的基因被鑒定。Depth sampling和Microarray的分析結(jié)果交互后確定

8、9個(gè)基因和已知的無(wú)毒基因具有類似的基因組結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄特征，其中之一為Avh27.已有的遺傳圖譜顯示該基因座落在Avr3c區(qū)域內(nèi).該基因在基因組上有3個(gè)paralog(2個(gè)Avh27a和1個(gè)Avh27b)，均位于33kb左右的重復(fù)大片段內(nèi).來(lái)自無(wú)毒菌株R2的Avh27a全長(zhǎng)或不含信號(hào)肽基因都可以誘導(dǎo)抗性基因Rps3c介導(dǎo)的大豆細(xì)胞死亡，Avh27b全長(zhǎng)或不含信號(hào)肽基因均不能誘導(dǎo)死亡，說(shuō)明Avh27a可能是無(wú)毒基因Avr3c。RT-PCR結(jié)果

9、顯示Avh27a在所有菌株中表現(xiàn)出一致的轉(zhuǎn)錄特征：接種后24h高量轉(zhuǎn)錄，卻在接種后48h均不轉(zhuǎn)錄。CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)標(biāo)記在F2的后代中的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Avh27a和Avr3c的毒性表型完全連鎖。同時(shí)Avh27a在不同菌株內(nèi)有4種alleles編碼3種不同的氨基酸序列，不同菌株中Avr3c序列的多態(tài)性和其在Rps3c大豆葉片上引發(fā)細(xì)胞死亡的能力以及該菌株的在Rps3c大豆葉片

10、上的毒性也是完全一致的.以上結(jié)果證明Avh27a就是大豆疫霉無(wú)毒基因Avr3c。 傳統(tǒng)的遺傳標(biāo)記結(jié)果顯示大豆疫霉的兩個(gè)無(wú)毒基因Avr3a和Avr5為緊密連鎖。最近發(fā)現(xiàn)p.sojae的無(wú)毒基因Avr1b，Avr1a，Avr3a和p.infestans的Avr3a在基因結(jié)構(gòu)上均具有信號(hào)肽和RXLR定位信號(hào).因此推斷無(wú)毒基因Avr5可能為一個(gè)或一組座落于Avr3a區(qū)域附近的含信號(hào)肽序列的RXLR基因.生物信息學(xué)技術(shù)掃描已克隆的Avr3

11、a附近的1 Mb區(qū)域得到了23個(gè)編碼RXLR分泌蛋白的閱讀框Open Reading Frame(ORF)。采用Microarray和半定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)候選ORF在毒性菌株和無(wú)毒菌株中的轉(zhuǎn)錄差異，并對(duì)所有的ORF進(jìn)行了測(cè)序，比較了毒性菌株和無(wú)毒菌株間的序列差異。利用大規(guī)模測(cè)序獲得的12個(gè)Cleaved Amplified Polymorphic Sequence(CPAS)標(biāo)記在120個(gè)F2后代中對(duì)Avr5進(jìn)行了精細(xì)作圖。作圖結(jié)

12、果將Avr5定位在一個(gè)77.7 kb的區(qū)域內(nèi)，該區(qū)域含有Avr3a，Avh36和Avh38等3個(gè)RXLR基因。RT-PCR、測(cè)序以及基因槍的結(jié)果顯示Avh36和Avh38不是Avr5。進(jìn)一步根據(jù)基因組結(jié)構(gòu)、菌株基因組RFLP、以及序列多態(tài)性綜合分析推測(cè)Avr5可能就是Avr3a-1. 本文從無(wú)毒基因Avr3a的基因組特征入手，發(fā)現(xiàn)了無(wú)毒基因在基因組上多存在多拷貝的特征，這是一個(gè)尚未報(bào)道的無(wú)毒基因新特征。根據(jù)這一重要線索，結(jié)合傳統(tǒng)