大豆疫霉卵孢子發(fā)育早期特異表達(dá)基因的篩選及分析.pdf

1、大豆疫霉（Phytophthorasojae）是一種土傳危害性的植物病原菌，由其引起的大豆根腐病能對(duì)大豆生產(chǎn)產(chǎn)生極大危害。目前的研究表明該病原菌的致病性易變，新的抗病品種會(huì)由于新的致病小種的出現(xiàn)而失去對(duì)大豆疫霉病的防治作用。因此，大豆疫霉根腐病如何能夠有效的防治始終是大豆生產(chǎn)上的難題，而通過了解其生長(zhǎng)發(fā)育與致病過程的相關(guān)分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其生長(zhǎng)與致病過程的關(guān)鍵基因，利用這些基因作為分子靶標(biāo)，從而能夠開發(fā)有效的病原菌防治策略。轉(zhuǎn)錄因子在真核生

2、物的生命活動(dòng)中扮演著重要的角色，通過開啟或關(guān)閉某個(gè)或某些基因在特定時(shí)期的表達(dá)，來調(diào)控生物有機(jī)體的特征與性狀，闡明大豆疫霉菌生長(zhǎng)發(fā)育與致病性的關(guān)鍵是在基因組水平上了解基因的表達(dá)與調(diào)控，借助轉(zhuǎn)錄因子的研究有利于對(duì)大豆疫霉菌細(xì)胞內(nèi)基因調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)和作用機(jī)制的理解。
　　 利用抑制差減雜交法對(duì)大豆疫霉有性發(fā)育初期特異表達(dá)基因進(jìn)行篩選，共篩選出183個(gè)序列，經(jīng)點(diǎn)雜交分析發(fā)現(xiàn)，其中41個(gè)unigene在卵孢子形成階段上調(diào)表達(dá)。說明這些基因在參

3、與卵孢子發(fā)育初期階段的調(diào)控，通過大豆疫霉數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索發(fā)現(xiàn)這些基因編碼的蛋白質(zhì)涉及能量合成、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞壁的生成和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等。選擇感興趣的11個(gè)基因，利用RT-PCR測(cè)定其在大豆疫霉不同生長(zhǎng)階段的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中有8個(gè)基因只在卵孢子形成階段表達(dá)，而MybDNA-bindingdomaingene,hypotheticalproteingeneandTubulin-tyrosineligasegene等3個(gè)基因在初始

4、即檢測(cè)到表達(dá)，說明這三個(gè)基因?qū)β焰咦拥脑缙诎l(fā)育可能起著關(guān)鍵的作用。
　　 利用基因沉默表達(dá)技術(shù)對(duì)一個(gè)可能參與卵孢子發(fā)育的大豆疫霉基因PsMyb1進(jìn)行了功能分析。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因含有2個(gè)內(nèi)含子，分別位于其啟始密碼子下游的第358和469堿基處，大小分別為73bp和78bp，根據(jù)堿基序列翻譯后的蛋白質(zhì)由605個(gè)氨基酸殘基組成，含有一個(gè)“SHLQKYR”(Ser-His-Leu-Gln-Lys-Tyr-Arg)保守序列。系統(tǒng)發(fā)育分

5、析表明，該轉(zhuǎn)錄因子多存在于植物中，且系統(tǒng)發(fā)育樹中還發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄因子在大豆疫霉和植物中的遺傳距離較遠(yuǎn)。利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)，將PsMyb1進(jìn)行轉(zhuǎn)錄基因沉默分析。轉(zhuǎn)錄水平的研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于野生型，PsMyb1基因沉默突變體中PsMyb1的相對(duì)表達(dá)水平明顯下降。表型分析發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，PsMyb1基因沉默突變體中卵孢子的形成受到影響，當(dāng)(WT)野生型的卵孢子產(chǎn)量為260-270個(gè)，PsMyb1沉默突變體的卵孢子產(chǎn)量為10-30個(gè)，表明沉默突