大豆疫霉無毒基因Avr3α識別位點及亞細胞定位分析.pdf

1、大豆根腐病嚴重威脅世界范圍內的大豆生產，每年在農業(yè)生產上都會造成上高達二十億美元的損失，而引起這種病害的病原菌就是大豆疫霉。大豆疫霉與真菌親緣關系較遠，傳統(tǒng)防治真菌的藥物對其效果不明顯，控制大豆疫霉根腐病的主要措施是培育抗病品種。無毒基因與抗病基因的互相識別會直接影響大豆疫霉致病性和大豆的抗病性。目前已有多種抗病基因和無毒基因被鑒定克隆。在大豆疫霉與大豆之間協(xié)同進化過程中，大豆疫霉會通過自身不斷變異來逃避抗病基因的識別，無毒基因在自然界

2、中的多態(tài)性就是它逃避識別的一種手段。研究無毒基因的多態(tài)性，尋找關鍵識別區(qū)域和位點對了解大豆疫霉致病機制，有效控制大豆根腐病具有重要意義。
　　PsAvr3a是已經被克隆的大豆疫霉的無毒基因，Avr3a在不同菌株P6497、P7064、ACR12、HN25、HN35中存在多態(tài)性，但在P7064中不轉錄?；谝延械难芯拷Y果，通過基因槍瞬時表達首先確認Avr3a中20個氨基酸左右的信號肽(signalpeptide，SP)對Avr3a-

3、Rps3a的識別沒有影響。將P6497、ACR12、HN25、HN35中缺失信號肽的Avr3a-SP在含有Rps3a的大豆葉片上瞬時表達，無毒菌株P6497、ACR12中的Avr3a能夠被Rps3a所識別，引起細胞壞死，而毒性菌株HN25、HN35中的Avr3a中不能被識別，這表明Avr3a-Rps3a的識別直接決定了Avr3a的無毒功能。其氨基酸突變位點主要集中在C端W-motif附近區(qū)域，生物信息學預測77位和82位氨基酸有可能是識

4、別的關鍵位點。因此將一系列Avr3a的缺失突變體在含有Rps3a的大豆葉片上瞬時表達，發(fā)現(xiàn)識別關鍵區(qū)域在第61位到第112位氨基酸的區(qū)域，Wmotif及其前后的區(qū)域對識別都很重要。分別將Avr3aP649777位的天冬氨酸(D)點突變?yōu)楦拾彼?G)，82位組氨酸(H)點突變?yōu)樘於彼?D)，突變體仍被Rps3a識別，而同時突變77位的天冬氨酸(D)為甘氨酸(G)，82位組氨酸(H)為天冬氨酸(D)，對Avr3a與Rps3a的識別有一定影

5、響。
　　對Avr3a的亞細胞定位研究發(fā)現(xiàn)，Avr3aP6497、Avr3aHN25亞細胞定位在細胞核、細胞質中。將Avr3aP6497的C端分別與核定位信號（NLS1和NLS2）和核輸出信號(NES)融合，發(fā)現(xiàn)NLS2、NES都改變了Avr3aP6497的定位而NLS1沒有改變Avr3aP6497的定位;將Avr3aHN25的C端核定位信號(NLS2)和核輸出信號(NES)融合，發(fā)現(xiàn)NLS2、NES也改變了Avr3aHN25的定