大豆CDPK蛋白基因CDPK-SK5的分離、表達(dá)分析與亞細(xì)胞定位.pdf

1、CDPKs(鈣依賴蛋白激酶)是一類僅在植物和部分原生物中存在的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在鈣離子介導(dǎo)的信號(hào)傳遞、植物生長(zhǎng)發(fā)育以及植物響應(yīng)生物和非生物脅迫中起重要作用，但大多數(shù)CDPKs的功能仍不是很清楚。由于大豆種子蛋白(約40％)和油脂(約20％)含量高，在種子發(fā)育成熟及貯藏過(guò)程中常會(huì)遇到高溫高濕等脅迫因子，從而導(dǎo)致種子劣變。本實(shí)驗(yàn)室在鑒定出大豆種子田間劣變抗性不同品種的基礎(chǔ)上，對(duì)抗種子田間劣變和不抗種子田間劣變大豆種質(zhì)的差異蛋白質(zhì)組學(xué)

2、進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，不抗種子田間劣變的寧鎮(zhèn)1號(hào)大豆種子經(jīng)高溫高濕脅迫后CDPK-SK5蛋白(NCBI GenBank:LOC547885)呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。本研究在此基礎(chǔ)上對(duì)大豆的CDPK-SK5基因以及啟動(dòng)子序列進(jìn)行了分離和生物信息學(xué)分析;并對(duì)高溫高濕脅迫條件下CDPK-SK5基因的時(shí)空表達(dá)模式進(jìn)行了研究;通過(guò)構(gòu)建CDPK-SK5::GFP融合載體，對(duì)CDPK-SK5基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位研究;本研究的主要結(jié)果如下:
　　 1、以

3、寧鎮(zhèn)1號(hào)和湘豆3號(hào)大豆葉片為材料，分離鑒定出了大豆CDPK蛋白基因CDPK-SK5序列，并對(duì)其生物信息學(xué)特征進(jìn)行了分析。同時(shí)，分離得到CDPK-SK5基因的啟動(dòng)子序列，并通過(guò)PLACE和Promotor preditions軟件在線預(yù)測(cè)軟件對(duì)其序列進(jìn)行了分析。CDPK-SK5基因的cDNA序列包含由1527個(gè)核苷酸組成的完整開(kāi)放閱讀框(ORF)，此ORF編碼508個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì);該蛋白序列存在α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和隨機(jī)卷

4、曲結(jié)構(gòu);多肽鏈表現(xiàn)為親水性，不存在跨膜結(jié)構(gòu)域;含有多個(gè)潛在的Ser、Thr、Tyr磷酸化位點(diǎn)，可能定位于葉綠體中。通過(guò)植物啟動(dòng)子順式調(diào)控元件預(yù)測(cè)軟件分析發(fā)現(xiàn)CDPK-SK5基因存在逆境脅迫響應(yīng)元件2個(gè)TATA盒、1個(gè)銅離子應(yīng)答元件(GTAC)、3個(gè)ABA應(yīng)答元件的類似序列(ABRE-like)、1個(gè)MYC應(yīng)答元件、5個(gè)W盒、1個(gè)MYB應(yīng)答元件、1個(gè)乙烯應(yīng)答元件(ERE)和3個(gè)CAAT盒;大豆種子特異性啟動(dòng)子的順式作用元件包括1個(gè)RY r

5、epeat、1個(gè)SEF1 motif、1個(gè)SEF4 motif和9個(gè)E盒;光調(diào)節(jié)啟動(dòng)子中存在的順式作用元件包括5個(gè)GT-1位點(diǎn)、2個(gè)I-盒和4個(gè)GATA-box。
　　 2、通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)對(duì)CDPK-SK5基因在高溫高濕、低溫等非生物脅迫和器官特異性的表達(dá)模式進(jìn)行了研究。研究發(fā)現(xiàn)CDPK-SK5經(jīng)高溫高濕和低溫脅迫處理后，種子田間劣變抗性不同的寧鎮(zhèn)1號(hào)和湘豆3號(hào)大豆種子中CDPK-SK5基因的表達(dá)存在差異，在

6、0h和168h兩者差異不顯著，24h至96h兩者差異顯著，均表現(xiàn)為種子田間劣變抗性品種湘豆3號(hào)的表達(dá)量顯著高于不抗品種寧鎮(zhèn)1號(hào)，在24h和96h差異達(dá)到極顯著水平。CDPK-SK5經(jīng)低溫脅迫處理后，隨低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，種子田間劣變抗性不同的寧鎮(zhèn)1號(hào)和湘豆3號(hào)大豆種子中CDPK-SK5基因的表達(dá)也存在差異。在7h和24h兩者表達(dá)量差異不顯著;在0h和19h，寧鎮(zhèn)1號(hào)的表達(dá)量極顯著高于湘豆3號(hào)的表達(dá)量;在14h，湘豆3號(hào)的表量極顯著高于寧

7、鎮(zhèn)1號(hào)的表達(dá)量。并且，CDPK-SK5基因在不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)也具有顯著差異。CDPK-SK5基因在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期和生殖生長(zhǎng)時(shí)期均中呈先下調(diào)后上調(diào)表達(dá)的趨勢(shì);營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期，S期的表達(dá)量極顯著低于R期和L期;生殖生長(zhǎng)時(shí)期，MS期的表達(dá)量極顯著高于F期至GS期的表達(dá)量，但F期至GS期的表達(dá)量差異不顯著。
　　 3、基因槍轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞的瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CDPK-SK5蛋白定位于細(xì)胞核和細(xì)胞膜。
　　 本研究的CDPK-