弓形蟲CDPK1-EF基因的克隆表達及其免疫學特性研究.pdf

1、弓形蟲?。═oxoplasmosis）是由剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）寄生于人和多種動物有核細胞內所引起的人獸共患原蟲病，該病廣泛流行于世界各地。弓形蟲不僅對人類健康構成嚴重威脅，還給畜牧業(yè)生產造成嚴重經濟損失。目前，弓形蟲病的防治主要通過化學治療方法，但其存在副作用大、易復發(fā)、易產生抗藥性以及畜禽產品的藥物殘留等弊端，因此，開展對弓形蟲病流行特點以及弓形蟲疫苗的研究是當前該領域重要方向之一，研制安全、高效的疫苗是預

2、防弓形蟲病首選策略。CDPKs是一類不依賴鈣調素的蛋白激酶，其可參與調控寄生蟲的入侵、外出宿主細胞、配子的形成、在宿主體內移行等關鍵生理活動，是弓形蟲發(fā)育過程中重要的功能蛋白之一。然而，目前關于該對弓形蟲CDPKs的免疫保護力的研究資料較為匱乏，因此，對其深入研究不僅有助于闡明該抗原作用的免疫機制，同時也為其作為弓形蟲疫苗候選抗原的篩選提供基本依據。
　　首先，采用RT-PCR技術對弓形蟲 RH株速殖子鈣依賴蛋白激酶 EF模體(T

3、gCDPK1-EF)基因進行體外擴增、測序，將目的片段的核酸序列及其編碼氨基酸序列與已公布的、在分類上相近的其他原蟲該蛋白的相同區(qū)域進行同源性比對。同時，克隆至表達載體pET-32a，構建重組質粒pET-32a-TgCDPK1-EF，然后經IPTG誘導目的蛋白的表達，并鑒定目的蛋白的表達形式，采用Ni-NTA親和層析法純化可溶性目的蛋白。
　　隨后，將上述重組蛋白與弗氏完全佐劑（首免小鼠）及弗氏不完全佐劑（二免、三免小鼠）充分乳化

4、，制備成免疫原，間隔15d，免疫劑量為0.1mg/只。三免后第7d，進行斷尾采血分離血清，并分別采用Western-blot檢測重組蛋白的反應原性，間接ELISA法檢測產生特異性抗體的效價。同時，利用熒光定量PCR技術，對免疫小鼠的脾臟組織中IFN-γ、IL-4、TLR4等免疫相關基因在mRNA水平上進行定量。并以每只小鼠10000個蟲體的量腹腔注射免疫小鼠，觀察小鼠存活時間，以檢測重組蛋白對弓形蟲感染小鼠的免疫保護力。
　　實驗

5、結果表明：(1)成功滴克隆出TgCDPK1-EF模體區(qū)基因，序列比對發(fā)現其在核酸水平上與其他不同型蟲株的EF模體區(qū)基因高度保守，與RH株ME(XM_002371625.1)蟲株的同源性達100％，而與其他原蟲的CDPKs的EF模體區(qū)基因差異較大，其中與牛艾美耳球蟲(FJ873128.1)同源性僅為70.0%；在氨基酸序列上，與瘧原蟲或與隱孢子蟲CDPKs-EF的氨基酸序列差異較大，而與弓形蟲RH株TgCDPK4最后一個EF模體區(qū)序列存在

6、三個氨基酸的差異。(2)構建表達載體pET32a-TgCDPK1-EF可在Rosseta菌株中以可溶性蛋白的形式穩(wěn)定表達。(3)重組蛋白具有良好的反應原性，并且能夠誘導機體對其產生特異性抗體，抗體的平均效價為1：14933；與對照組比較，重組蛋白免疫組小鼠在三免后第7d IL-4在轉錄水平上上調9.2倍，IFN-γ上調5.7倍，達到極顯著水平（P＜0.01）；對免疫小鼠攻蟲后3d及攻蟲后5d時，IL-4在轉錄水平上分別上調11.5倍和1

7、1倍，而IFN-γ在轉錄水平上明顯上調，分別為空白對照組的5.7倍和5.5倍，且攻蟲后與攻蟲前比較其差異達到極顯著水平（P＜0.01），而TLR-4的表達調節(jié)與重組蛋白的免疫無直接相關性，除了處于典型發(fā)病期的“空白攻蟲5d”組的實驗小鼠之外，其余各組的TLR-4 mRNA的表達量與空白對照組相比較均無顯著差異（P＞0.05）。重組蛋白對小鼠的免疫保護性試驗結果顯示：重組蛋白免疫組小鼠的平均發(fā)病時間為8.8d，平均病程時長為3d，平均存活

8、時間為12d，其他各對照組小鼠的平均發(fā)病時間為4.5d至4.8d，平均病程時長為2.8d至3.1d，平均存活時間為7.4d至7.8d。在發(fā)病時間上，重組蛋白免疫組與其他各對照組之間差異極顯著（P＜0.01）；病程時長上，各組小鼠之間差異均不顯著（P＞0.05）；存活時間上，重組蛋白免疫組與其他各組之間差異極顯著（P＜0.01）。
　　綜上所述，本實驗利用PCR技術，體外擴增出弓形蟲RH株CDPK1-EF模體區(qū)基因序列，通過構建原核