弓形蟲(chóng)病和廣州管圓線蟲(chóng)病的免疫學(xué)診斷研究.pdf

1、弓形蟲(chóng)主要表面抗原1(SAG1)是目前國(guó)內(nèi)外研究較多的具有強(qiáng)免疫原性的優(yōu)勢(shì)診斷分子，該研究前期工作已實(shí)現(xiàn)了SAG1在大腸桿菌的可溶性表達(dá)，且證實(shí)其具有良好的免疫反應(yīng)性。該文在此基礎(chǔ)之上，進(jìn)行了以下研究： 1.標(biāo)準(zhǔn)血清的鑒定標(biāo)準(zhǔn)血清的確定是評(píng)判試劑盒質(zhì)量的前提，該研究采用免疫電鏡技術(shù)確定免疫兔血清、SAG1單克隆抗體和正常兔血清中針對(duì)膜抗原的抗體的有無(wú)，并以此作為標(biāo)準(zhǔn)參考血清，建立玻片蟲(chóng)體酶聯(lián)染色試驗(yàn)(TSHE)和免疫印跡試驗(yàn)(I

2、B)方法；用TSHE和IB確定了一批弓形蟲(chóng)IgG和IgM抗體陽(yáng)性和陰性血清，為評(píng)價(jià)基于重組抗原的弓形蟲(chóng)檢測(cè)試劑盒提供了可靠的標(biāo)準(zhǔn)血清。 2.弓形蟲(chóng)rSAG1蛋白的表達(dá)、純化及鑒定標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒的構(gòu)建需要規(guī)?；a(chǎn)抗原，以搖菌方式獲得目標(biāo)蛋白因較難避免抗原的批間差異而滿足不了需要。該研究比較了搖菌、普通發(fā)酵和高密度發(fā)酵3種工藝生產(chǎn)重組弓形蟲(chóng)主要表面抗原1(rSAG1)的表達(dá)量和產(chǎn)量。結(jié)果3種所獲目標(biāo)蛋白的表達(dá)量均占菌體蛋白30％左右

3、。搖菌、普通發(fā)酵和高密度發(fā)酵所獲得目標(biāo)蛋白產(chǎn)量分別為1.65g/L、1.82g/L和6.74g/L。高密度發(fā)酵比普通發(fā)酵的成本低，一罐11.5L的高密度發(fā)酵可獲目標(biāo)蛋白77g，按常規(guī)包被量估算可以制備3千8百萬(wàn)人份的檢測(cè)試劑盒，滿足規(guī)?；a(chǎn)的要求。 為探索rSAG1純度對(duì)檢測(cè)效果的影響，該研究用Ni-NTA層析、Sephadex-G75層析和切膠純化等三種純化方案進(jìn)行配伍和條件優(yōu)化，摸索rSAG1的最佳純化工藝。SDS-PAG

4、E和凝膠分析結(jié)果顯示：經(jīng)Ni-NTA一步純化，純度為72.36％；經(jīng)Ni-NTA和Sephadex-G75兩步純化，純度為98.54％：經(jīng)Ni-NTA和切膠兩步純化，純度為97.39％。 為鑒定這3種工藝純化的rSAG1在ELISA檢測(cè)中的效果，該研究分別用這3種工藝純化的抗原包被ELISA板，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)血清，結(jié)果顯示：經(jīng)Ni-NTA一步純化的rSAG1與后2種工藝純化的抗原相比，敏感性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但特異性顯著低于后2種。Ni-

5、NTA和Sephadex-G75柱層析兩步純化工藝與Ni-NTA和切膠法兩步純化工藝相比，不僅操作簡(jiǎn)便、成本較低，而且可實(shí)現(xiàn)規(guī)?；?。該文采用此方法批量純化了rSAG1，實(shí)現(xiàn)了rSAG1蛋白的中試生產(chǎn)與純化。 3.該研究用弓形蟲(chóng)速殖子可溶性抗原、不同純度的融合型rSAG1和經(jīng)腸激酶切割后的非融合型rSAG1蛋白以及經(jīng)菌體蛋白或硫氧還蛋白吸收過(guò)的血清組合成6組ELISA檢測(cè)方案。結(jié)果表明：①低純度的融合型rSAG1-ELISA檢測(cè)方

6、案的特異性較高純度的融合型rSAG1-ELISA低，并且通過(guò)大腸桿菌預(yù)吸收血清處理難以達(dá)到理想的水平；②高純度的融合型rSAG1-ELISA檢測(cè)方案的特異性較非融合型rSAG1-ELISA檢測(cè)方案低，Westernblot結(jié)果表明這是由硫氧還蛋白引起的；③高純度的融合型rSAG1-ELISA檢測(cè)方案可以通過(guò)硫氧還蛋白預(yù)吸收血清處理而達(dá)到與非融合型rSAG1-ELISA相同、且較天然蟲(chóng)體抗原好的理想效果，且成本較低。結(jié)論：高純度的融合型r

7、SAG1可以達(dá)到弓形蟲(chóng)特異性IgG抗體檢測(cè)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的要求。 4.rSAG1特異性IgM抗體檢測(cè)體系的建立弓形蟲(chóng)IgM抗體陽(yáng)性提示近期感染，但用速殖子抗原建立的IgM檢測(cè)方法易受類(lèi)風(fēng)濕因子等因素干擾而出現(xiàn)非特異性反應(yīng)。該文分別用rSAG1和弓形蟲(chóng)速殖子可溶性抗原建立rSAG1-ELISA和TOXO-ELISA，檢測(cè)弓形蟲(chóng)IgM抗體陽(yáng)性和陰性血清，結(jié)果顯示：rSAG1-ELISA與TOXO-ELISA的敏感性相同，而rSAG

8、1-ELISA較TOXO-ELISA的特異性高。提示：rSAG1用于弓形蟲(chóng)IgM抗體的檢測(cè)優(yōu)于天然的蟲(chóng)體抗原，這為用rSAG1構(gòu)建弓形蟲(chóng)IgM抗體標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)試劑盒提供了依據(jù)。 該文用最佳包被濃度的羊抗人IgM包被ELISA板，并分別以rSAG1和速殖子可溶性抗原作結(jié)合抗原，分別以HRP標(biāo)記的兔抗弓形蟲(chóng)IgG和SAG1單克隆抗體(Y3A8和K7H3)作為結(jié)合抗體，配伍成8組C-ELISA方案，檢測(cè)弓形蟲(chóng)IgM抗體。結(jié)果顯示：兔抗弓

9、形蟲(chóng)IgG與rSAG1配伍較之與速殖子抗原配伍效果好；Y3A8無(wú)論是與rSAG1還是與弓形蟲(chóng)速殖子抗原配伍，反應(yīng)的OD值及P/N比值均較低；K7H3在與抗原的配伍中，OD值較Y3A8高；而Y3A8和K7H3聯(lián)合與rSAG1配伍時(shí)，OD值和P/N比值均為最高。進(jìn)一步用Y3A8和K7H3聯(lián)合與rSAG1組成的C-ELISA血清樣本，結(jié)果顯示：C-ELISA的特異性與rSAG1-ELISA相同，但其敏感性較rSAG1-ELISA低。進(jìn)一步提示

10、rSAG1在弓形蟲(chóng)IgM抗體檢測(cè)中具有潛能。 5.弓形蟲(chóng)標(biāo)準(zhǔn)化rSAG1-ELISA試劑盒的構(gòu)建與應(yīng)用在上述研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)了一系列制作工藝的優(yōu)化：①以最佳包被濃度包被ELISA板；②從4種不同配方的封閉液中挑選效果最佳者對(duì)抗原板進(jìn)行封閉；③根據(jù)抗原板在不同條件下存放不同時(shí)間后的檢測(cè)效果，從3種不同配方的保護(hù)劑中挑選最佳者對(duì)抗原板進(jìn)行保護(hù)處理；④從5種不同配方的血清稀釋液挑選P/N值最高且OD值大于0.5者作為試劑盒的血清

11、稀釋液；⑤采用棋盤(pán)法從3種不同配方的稀釋液與酶結(jié)合物的濃度選擇最佳者作為試劑盒的酶結(jié)合物；⑥用棋盤(pán)法確定試劑盒的血清和酶結(jié)合物的作用時(shí)間和洗滌條件；⑦檢測(cè)1170例普查血清，計(jì)算OD450平均值和SD，以平均值×2.1+2SD為判斷標(biāo)準(zhǔn)；并經(jīng)多次重復(fù)測(cè)定的變異系數(shù)制定試劑盒的臨界值參考血清；⑧配以陰陽(yáng)性參考血清、穩(wěn)定的濃縮洗滌液、底物液、顯色液和外包裝盒；構(gòu)建rSAG1-IgG-ELISA和rSAG1-IgM-ELISA檢測(cè)試劑盒。

12、 試劑盒的性能： 1)隨機(jī)抽取10份血清在保質(zhì)期內(nèi)的不同時(shí)間進(jìn)行10次測(cè)試，測(cè)試結(jié)果10份標(biāo)本的變異系數(shù)都在5％以下，表明試劑盒的重復(fù)性好。 2)根據(jù)中國(guó)藥品監(jiān)督管理局的檢定要求，將構(gòu)建的試劑盒于4℃保存、37℃放置1d、2d、3d后檢測(cè)10例陽(yáng)性血清樣本。結(jié)果10例樣本的OD值均在臨界值之上，表明試劑盒的保質(zhì)期至少為半年。試劑盒的單項(xiàng)穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明：抗原板室溫存放2年后，血清稀釋液、底物液和顯色液4℃存放1年以

13、后，檢測(cè)結(jié)果都在可靠范圍內(nèi)。表明試劑盒的穩(wěn)定性好。 3)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)血清的鑒定，rSAG1-IgG-ELISA試劑盒的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)示值、陰性預(yù)示值和符合率均在97％以上，約登指數(shù)為0.95。rSAG1-IgM-ELISA試劑盒的敏感性為92.8％，特異性為100％，約登指數(shù)為0.93，與TSHE和IB的符合率為98.4％。 4)與國(guó)內(nèi)外同類(lèi)產(chǎn)品比較結(jié)果顯示：rSAG1-IgG-ELISA試劑盒與意大利DIESSE弓形

14、蟲(chóng)檢測(cè)試劑盒和某國(guó)產(chǎn)試劑盒相比，敏感性和特異性不具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但約登指數(shù)(0.95)較DIESSE(0.93)和國(guó)內(nèi)(0.74)產(chǎn)品高。rSAG1-IgM-ELISA檢測(cè)試劑盒的敏感性顯著高于國(guó)產(chǎn)試劑盒，而且約登指數(shù)(0.93)高于DIESSE(0.86)和國(guó)內(nèi)(0.27)產(chǎn)品。從整體性能來(lái)看，rSAG1-IgG-ELISA和rSAG1-IgM-ELISA檢測(cè)試劑盒優(yōu)于所檢測(cè)的國(guó)內(nèi)外同類(lèi)產(chǎn)品。 試劑盒的應(yīng)用： 用rSAG

15、1-IgG-ELISA和rSAG1-IgM-ELISA試劑盒檢測(cè)1714例血清，結(jié)果顯示：IgG總陽(yáng)性率為8.27％，IgM總陽(yáng)性率為0.88％，IgG和IgM同時(shí)陽(yáng)性為0.18％。省CDC等十多家單位應(yīng)用后，對(duì)此試劑盒的性能和診斷效果均給予了較高的評(píng)價(jià)。 該研究對(duì)不同發(fā)育階段的廣州管圓線蟲(chóng)抗原成分及其免疫反應(yīng)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：不同階段的蟲(chóng)體蛋白譜大致相同；各階段蟲(chóng)體及雌、雄蟲(chóng)存在的差異性蛋白條帶中，除雌蟲(chóng)Mr33000與感

16、染早期大鼠血清出現(xiàn)免疫反應(yīng)外，其他條帶在Westernblot中均未出現(xiàn)反應(yīng)。各個(gè)發(fā)育階段蟲(chóng)體的Mr40000、50000、66000和80000能被感染大鼠血清識(shí)別，但與感染后1周大鼠和健康大鼠血清也出現(xiàn)反應(yīng)，提示這些分子可能在用蟲(chóng)體粗抗原作靶抗原的免疫診斷中引起非特異性反應(yīng)。2～3周幼蟲(chóng)的Mr104000抗原與感染后2周的大鼠血清出現(xiàn)強(qiáng)烈的反應(yīng)帶，而隨著蟲(chóng)齡的增長(zhǎng)，該區(qū)帶的反應(yīng)變?nèi)?，推測(cè)該抗原為廣州管圓線蟲(chóng)的期特異性抗原，具有潛在的

17、早期診斷價(jià)值。雌蟲(chóng)的Mr33000及所有蟲(chóng)體的Mr32000抗原與2周感染血清出現(xiàn)反應(yīng)，與感染3周后大鼠血清均出現(xiàn)強(qiáng)反應(yīng)，與正常大鼠血清均未見(jiàn)明顯的反應(yīng)，說(shuō)明Mr32000和33000抗原在廣州管圓線蟲(chóng)病的早期診斷和流行病學(xué)調(diào)查具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。 利用切膠法從廣州管圓線蟲(chóng)粗抗原中純化出Mr32000(AC32)，并構(gòu)建了AC32-ELISA和免疫膠體金滲濾(DIGFA)檢測(cè)體系。兩個(gè)體系檢測(cè)40份感染3w的大鼠血清和21份感染

18、4-6w大鼠血清全部為陽(yáng)性，1例臨床確診的廣州管圓線蟲(chóng)病人血清呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)；5例正常大鼠血清和50例獻(xiàn)血員血清未出現(xiàn)假陰性反應(yīng)，與20例急性血吸蟲(chóng)病人血清、45例華支睪吸蟲(chóng)病人血清等其它寄生蟲(chóng)感染人血清均未出現(xiàn)交叉陽(yáng)性反應(yīng)。表明AC32-ELISA和AC32-DIGFA試劑盒具有較高的敏感性和特異性，而且可以用于廣州管圓線蟲(chóng)病的早期診斷。試用單位也對(duì)AC32-ELISA試劑盒作出了較好的評(píng)價(jià)。這為該試劑盒的進(jìn)一步研發(fā)打下了基礎(chǔ)。DIGF