廣州管圓線蟲病早期優(yōu)勢診斷抗原的篩選與初步鑒定.pdf

1、廣州管圓線蟲[Angiostrongylus cantonesis]是動物寄生蟲，終宿主為哺乳動物，主要是鼠類，中間宿主是陸生螺類或淡水螺類，如瑪瑙螺、福壽螺、蛞蝓等。大鼠是適宜終宿主，人和小鼠是非適宜宿主。成蟲寄生于鼠類肺部血管，幼蟲可侵入人體和小鼠體內(nèi)侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起神經(jīng)系統(tǒng)病變，導(dǎo)致嗜酸性粒細胞增多性腦膜炎或腦膜腦炎。臨床癥狀復(fù)雜多樣，給診斷帶來一定的困難。 Nomura等于1945年在臺灣報道了第一例廣州管圓線蟲

2、病。迄今為止，全世界已有報道廣州管圓線蟲病3000多例。隨著人們生活方式和飲食習(xí)慣的改變，廣州管圓線蟲病的流行已由太平洋沿岸地區(qū)擴展到美國、歐洲、澳大利亞等地區(qū)，在我國福建、臺灣等多個地區(qū)不斷出現(xiàn)多次散發(fā)或暴發(fā)病例。特別是最近兩次大的暴發(fā)流行均因食用生的或不熟的螺肉引起，其中包括2006年6月—9月北京暴發(fā)廣州管圓線蟲病，臨床確診達160例之多；2008年4月云南大理州發(fā)現(xiàn)33例廣州管圓線蟲病。廣州管圓線蟲病日益成為威脅人民群眾健康的重

3、大傳染病之一，引起了衛(wèi)生工作者的重視。2003年衛(wèi)生部將廣州管圓線蟲病列為我國新發(fā)傳染病。廣州管圓線蟲病已成為嚴重威脅人類健康的人獸共患病之一，積極開展該病的早期診斷和防治研究工作有著重要的現(xiàn)實意義，而快速有效的診斷方法是預(yù)防和治療該病的首要條件。 廣州管圓線蟲病現(xiàn)有的各種實驗室檢查中酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）是效果最好且方便推廣使用的檢測方法，而衡量ELISA檢測可靠性的關(guān)鍵是敏感性高、特異性強的診斷抗原、抗體。目前的臨床

4、檢測中，診斷抗原往往以粗抗原為主，常因缺乏特異性的診斷靶標(biāo)而與其他病原體存在交叉反應(yīng)，檢測結(jié)果不理想。IgM是病原體感染早期產(chǎn)生的抗體，從廣州管圓線蟲體蛋白中篩選出產(chǎn)生IgM的特異性抗原成分，對廣州管圓線蟲病的早期診斷具有重要意義。 1.研究目的 1.1.探索廣州管圓線蟲病早期診斷時機。 1.2.篩選廣州管圓線蟲病早期優(yōu)勢診斷抗原。 2.研究方法 2.1.從感染廣州管圓線蟲的福壽螺中分離三期幼蟲，

5、感染六周齡Balb/c小白鼠，分別于感染前及感染后的第1、2、3、4、8、16、21、28、38天斷尾取血。 2.2.經(jīng)方陣滴定確定最佳抗原包被量和血清最佳工作濃度，進一步測定小鼠感染廣州管圓線蟲后不同時期血清中IgM含量，留取IgM抗體含量優(yōu)勢血清。 2.3.用廣州管圓線蟲Ⅳ期幼蟲粗抗原分別與感染廣州管圓線蟲前后的小鼠血清進行免疫印跡，篩選早期優(yōu)勢診斷抗原。 2.4.從SDS—PAGE膠中回收純化具有早期優(yōu)勢診

6、斷價值的蛋白成分。 2.5.Western—blotting驗證回收蛋白活性和免疫反應(yīng)性。 2.6.方陣滴定確定抗原最佳包被濃度和血清最佳工作濃度，與Ⅳ期幼蟲粗抗ELISA法同時檢測感染小鼠血清、廣州管圓線蟲病人血清及其他寄生蟲病人血清。 2.7.統(tǒng)計學(xué)方法分析比較二者檢測的敏感性和特異性，評價回收蛋白檢測價值。 3.研究結(jié)果 3.1.小鼠感染廣州管圓線蟲后，其血清中特異性IgM抗體水平，在感染后

7、第一天即有上升趨勢，第1、2天上升緩慢，第3天開始快速升高。 3.2.感染后第4天血清IgM抗體檢測陽性率為48.33%（29/60），第8天血清IgM抗體檢測陽性率已達95%（57/60）；感染后第16—20天IgM抗體水平基本持平，為第一個高峰，此時血清中IgM抗體檢測陽性結(jié)果仍在90%以上，其中第16天為94.44%（51/54），第20天為90.70%（39/43）；感染后第28天下降到一個低值幾乎與感染后第4天IgM抗

8、體水平持平，此時陽性檢測率為46%（6/13）。 3.3.用感染廣州管圓線蟲后第8天血清，從廣州管圓線蟲Ⅳ期幼蟲粗抗原中成功篩選出具有早期優(yōu)勢診斷價值的32KD蛋白。 3.4.成功回收32KD蛋白，經(jīng)Western—blotting驗證回收成分具有很強的蛋白活性和免疫反應(yīng)性。 3.5.經(jīng)ELISA檢測并與Ⅳ期幼蟲粗抗原的檢測結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析，回收蛋白的診斷特異性明顯高于Ⅳ期幼蟲粗抗原；敏感性雖無統(tǒng)計學(xué)差別，卻較