廣州管圓線蟲cDNA文庫的構(gòu)建分析及廣州管圓線蟲病療效考核抗原的篩選鑒定.pdf

1、廣州管圓線蟲病(Angiostrongyliasis)是由廣州管圓線蟲(Angiostrongyluscantonensis)感染而引起的。作為一種新發(fā)的食源性傳染性疾病，廣州管圓線蟲病在全球的流行都呈現(xiàn)出上升的趨勢，對人類的威脅也越來越大。廣州管圓線蟲主要侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起嗜中性粒細(xì)胞增多性腦膜炎或腦膜腦炎。感染該病后，絕大多數(shù)患者有頭痛、肌肉痛、惡心、嘔吐、感覺異常、觸摸痛、發(fā)熱、畏光、視力模糊、嗜睡、頸硬等癥狀。其中以頭痛最突

2、出，患者自訴“頭痛欲裂”或忍受不了；全身疼痛、皮膚過敏的現(xiàn)象也比較嚴(yán)重；個(gè)別病人還會出現(xiàn)精神病樣癥狀。我國是廣州管圓線蟲病的主要流行區(qū)之一，近幾年的發(fā)病數(shù)逐漸增多，甚至出現(xiàn)了爆發(fā)流行。如何有效地防治廣州管圓線蟲病已成為亟待解決的重要問題。 在廣州管圓線蟲病的防治工作中，診斷是關(guān)鍵。診斷明確，治療及時(shí)，則病人的轉(zhuǎn)歸一般良好。但目前國內(nèi)外都還缺乏敏感特異、能產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)、標(biāo)準(zhǔn)化的診斷試劑盒。針對目前這個(gè)難點(diǎn)問題，本論文進(jìn)行了以下研究：

3、 一、廣州管圓線蟲幼蟲cDNA文庫的構(gòu)建與幼蟲、成蟲基因表達(dá)模式分析 鑒于廣州管圓線蟲在人體的感染和致病階段主要為幼蟲，本文構(gòu)建了廣州管圓線蟲腦期幼蟲的cDNA文庫，并用EST(expressedsequencetag)方法對其基因表達(dá)譜和成蟲的基因表達(dá)譜進(jìn)行了初步分析，目的是對此新發(fā)傳染病病原的分子生物學(xué)特征進(jìn)行了解和為診斷性抗原的篩選提供庫源。 從感染廣州管圓線蟲3周的大鼠腦部挑取幼蟲，提取其總RNA，運(yùn)用“

4、SMARTcDNA文庫構(gòu)建試劑盒”構(gòu)建其cDNA文庫。所建文庫的初始滴度為2.19×106pfu/ml，經(jīng)1次擴(kuò)增后的滴度為1.0×1010pfu/ml，插入子的平均長度為1.2kb，重組率為97.3％。 分別將成蟲cDNA文庫和我室構(gòu)建的幼蟲cDNA文庫中的噬菌體克隆轉(zhuǎn)化成噬菌粒，用5'端測序引物進(jìn)行測序。利用BLAST程序?qū)Λ@取的EST從核苷酸和氨基酸水平進(jìn)行同源性搜索，對成蟲和幼蟲的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。從成蟲的cDNA文庫

5、中得到64個(gè)EST，其中與其它基因有同源性的EST有54個(gè)，占82.8％；沒有同源性的EST有10個(gè)，占17.2％。64個(gè)成蟲EST序列中，rRNA基因49個(gè)，占總EST數(shù)的76.6％。從幼蟲的cDNA文庫中共得到106個(gè)EST，其中與其它基因有同源性的EST有91個(gè)，占85.8％；無同源性的EST有15個(gè)，占14.2％。106個(gè)幼蟲EST序列中rRNA基因78個(gè)，占總EST數(shù)的73.6％。本研究首次成功構(gòu)建了廣州管圓線蟲幼蟲的cDNA

6、文庫，EST分析顯示廣州管圓線蟲幼蟲和成蟲基因表達(dá)譜中rRNA基因均占大多數(shù)。 二、廣州管圓線蟲新基因的發(fā)現(xiàn)及初步研究 應(yīng)用EST策略，我們從廣州管圓線蟲腦期幼蟲cDNA文庫中篩到了兩個(gè)包含全長讀碼框的cDNA序列G40基因及G172基因，并已在GenBank中登錄(登錄號分別是DQ384534及DQ384535)。G40及G172基因分別與秀麗桿線蟲半凝乳素-8及膠原蛋白140高度同源。從保守結(jié)構(gòu)域的搜索結(jié)果可知，G4

7、0具有半凝乳素結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域能專一性地與β-半乳糖苷結(jié)合，如乳糖，而不需要金屬離子的活化。半凝乳素以二聚體或三聚體結(jié)構(gòu)域存在，它們進(jìn)程性地受到調(diào)節(jié)，還可能參與了細(xì)胞分化、細(xì)胞與細(xì)胞的相互作用及細(xì)胞調(diào)節(jié)。G172基因編碼的蛋白經(jīng)保守結(jié)構(gòu)域的搜索，沒有發(fā)現(xiàn)有已報(bào)道的結(jié)構(gòu)域。G40及G172基因分別用pET32a(+)質(zhì)粒在BL21大腸桿菌中表達(dá)，G40基因的表達(dá)產(chǎn)物與感染大鼠血清有明顯的免疫反應(yīng)性，是種具有潛力的診斷用抗原，而G172基因

8、在pET32a(+)/BL21系統(tǒng)中不表達(dá)，可能與該蛋白對細(xì)胞具有毒性有關(guān)。 三、廣州管圓線蟲病療效考核大鼠模型的建立 本研究從褐云瑪瑙螺中分離Ⅲ期幼蟲，以50條/只腹腔接種感染SD大鼠。于治療前從各組分別抽取感染鼠解剖觀察廣州線蟲的感染情況，確定各組大鼠均感染成功后，用50、100和200mg/kg/d3個(gè)不同劑量的阿苯達(dá)唑分別對感染大鼠進(jìn)行連續(xù)3天的治療。 為保證感染大鼠能得到有效的治療，采用了3個(gè)不同劑量的

9、阿苯達(dá)唑分別對感染大鼠進(jìn)行治療，但21w后仍有少數(shù)大鼠體內(nèi)檢獲到蟲體。這有可能是所用動(dòng)物的樣本量不同或所用藥物的批號不同所致。63只感染大鼠中，總共41只大鼠未檢獲到蟲體，治療的總有效率達(dá)65.1％(41/63)。實(shí)驗(yàn)過程中每2周采集大鼠血清，建立了這41只大鼠的感染前、感染后以及治療后不同時(shí)期的血清。該大鼠血清足夠用于廣州管圓線蟲病療效考核抗原的篩選。 四、廣州管圓線蟲病療效考核分子的篩選與鑒定 針對廣州管圓線蟲療效考

10、核問題，建立了進(jìn)行療效考核的大鼠動(dòng)物模型，分析了治療前后廣州管圓線蟲感染大鼠血清中IgG抗體的消長，篩選潛在的療效考核抗原分子。方法是用治療前后廣州管圓線蟲感染的大鼠血清與廣州管圓線蟲進(jìn)行免疫印跡反應(yīng)。結(jié)果顯示分子量于38kDa～78kDa之間的抗原分子與未經(jīng)治療和驅(qū)蟲治療后的感染大鼠血清的反應(yīng)帶無明顯差別，分子量為19kDa和17kDa的抗原與未經(jīng)治療感染大鼠血清出現(xiàn)較強(qiáng)的反應(yīng)，而與治療后血清未出現(xiàn)反應(yīng)帶，32kDa和24kDa抗原與

11、未經(jīng)治療感染大鼠血清出現(xiàn)較強(qiáng)的反應(yīng)，而與治療后大鼠血清的反應(yīng)帶明顯變?nèi)?；治療后血清與蟲體抗原在16kDa處出現(xiàn)反應(yīng)帶，而治療前血清在該處未見反應(yīng)帶；AC-IgG抗體在感染大鼠治療后17周的陰轉(zhuǎn)率達(dá)80％(8/10)。因而我們得出結(jié)論，廣州管圓線蟲19kDa，17kDa，32kDa，24kDa，16kDa抗原具有潛在的療效考核價(jià)值。 綜上所述，本文構(gòu)建了廣州管圓線蟲腦期幼蟲的cDNA文庫，并用EST方法對其基因表達(dá)譜和成蟲的基因表

12、達(dá)譜進(jìn)行了初步分析，對廣州管圓線蟲的分子生物學(xué)特征進(jìn)行了解和為診斷性抗原的篩選提供庫源。成功建立了廣州管圓線蟲療效考核大鼠模型，獲得了一批廣州管圓線蟲感染前、治療前以及治療后不同時(shí)期的大鼠血清。利用這些療效考核血清從廣州管圓線蟲成蟲可溶性抗原中篩選到一批具有潛在療效價(jià)值的抗原分子，并對其中的Mr32000抗原(AC32)進(jìn)行了純化，利用純化的AC32建立了廣州管圓線蟲療效考核檢測體系，解決了目前廣州管圓線蟲診斷試劑緊缺問題，為廣州管圓線