夾心ELISA法檢測廣州管圓線蟲病循環(huán)抗原及初步應用.pdf

1、廣州管圓線蟲(AngiostrongyluscantonensisAC)的幼蟲可侵入人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導致嗜酸性粒細胞增多性腦膜炎或腦膜腦炎，稱為廣州管圓線蟲病，簡稱“酸腦”。而該病的確診依據(jù)，主要是從患者腦脊液、眼或尸解時從腦、脊髓腔或肺動脈查到廣州管圓線蟲幼蟲、幼齡成蟲，但實際上蟲體檢出率很低，效果不太理想。
　　 自20世紀50年代以來，免疫學和免疫檢測技術(shù)的發(fā)展為廣州管圓線蟲病提供了科學的診斷手段，同時隨著免疫學方法的改

2、進和創(chuàng)新，大大提高了廣州管圓線蟲病診斷的準確性。檢測廣州管圓線蟲病患者血清抗體存在以下缺陷：一是感染后抗體出現(xiàn)較晚；二是完全治愈后抗體仍會存在較長時間，無法進行現(xiàn)癥感染診斷和療效考核；三是與其他蠕蟲存在交叉反應。檢測循環(huán)抗原(CAg)則可以克服以上的問題，因此我們對夾心ELISA法檢測廣州管圓線蟲病患者血清中循環(huán)抗原進行研究非常有意義。
　　 目的：
　　 制備抗廣州管圓線蟲五期幼蟲55KD抗原的單克隆抗體和相應的多克隆

3、抗體，采用雙抗體夾心ELISA法檢測廣州管圓線蟲病人血清中的循環(huán)抗原，并確定最佳檢測條件，探討其在廣州管圓線蟲病檢測方面的意義。
　　 方法：
　　 (1)電滲純化廣州管圓線蟲五期幼蟲55KD抗原，并用此抗原免疫小鼠后，進行細胞融合，有限稀釋法篩選出高滴度分泌McAb的雜交瘤細胞株，獲取分泌抗廣州管圓線蟲五期幼蟲55KD抗原的雜交瘤細胞株。蛋白質(zhì)免疫印跡(Westernblotting)及間接ELISA分析其特異性，初步

4、探討其在廣州管圓線蟲病診斷及治療中的應用。
　　 (2)用廣州管圓線蟲五期幼蟲55KD抗原免疫兔子，制備多克隆抗體。用多克隆抗體和單克隆抗體建立雙抗體夾心ELISA法檢測廣州管圓線蟲病人血清中循環(huán)抗原，并確定最佳檢測條件，利用該法進行人群血清檢測。
　　 結(jié)果：
　　 (1)篩選出2株高滴度分泌抗廣州管圓線蟲五期幼蟲55KD抗原的雜交瘤細胞株，分別命名為AVC1和ACV2。Westernblotting顯示2株單

5、克隆抗體均能與廣州管圓線蟲五期幼蟲55KD抗原發(fā)生特異性結(jié)合，經(jīng)免疫球蛋白類和亞類鑒定均為IgG2b，免疫組化結(jié)果顯示2株單克隆抗體與廣州管圓線蟲五期幼蟲的識別部位主要是在廣州管圓線蟲體表和消化道。
　　 (2)雙抗體夾心ELISA法檢測條件的確定
　　 包被抗原濃度選定為1.0mg/ml，檢測抗體的最佳工作濃度應在0.2mg/1，酶標抗體的最佳工作濃度應在1∶1000，包被方式和封閉方式分別為4℃包被過夜、37℃封閉2

6、小時，反應時間為標本孵育時間60分鐘、檢測抗體孵育時間60分鐘、酶結(jié)合物孵育時間45分鐘的反應體系。
　　 (3)建立雙抗體夾心ELISA法，檢測諸暨、溫州、樂清、瑞安和蒼南等地的人群血清，對應陽性率分別為0.6％、0.59％、0.57％、0.98％、2.43％、1.86％、1.18％。
　　 結(jié)論:
　　 (1)制備的2株穩(wěn)定分泌抗廣州管圓線蟲五期幼蟲55KD抗原單克隆抗體的雜交瘤細胞株，特異性和穩(wěn)定性較好，有