牛γ干擾素抗原捕獲ELISA檢測方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、牛結(jié)核病是由牛結(jié)核分枝桿菌感染引起的一種重要人獸共患病。牛結(jié)核分枝桿菌可以感染奶牛、鹿、獾等20多種溫血動物，還可以通過呼吸道及消化道途徑感染人類。研究表明，10％的人類結(jié)核病例由牛結(jié)核分枝桿菌感染引起，所以牛結(jié)核病不僅給畜牧業(yè)造成重大經(jīng)濟損失還嚴(yán)重威脅人類健康。 由于目前尚無有效疫苗預(yù)防牛結(jié)核病，所以各國普遍采取“檢疫-撲殺”策略控制疾病傳播。結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)實驗(Tuberculin skintest，TST)一直被用于

2、牛結(jié)核病的檢測，但其敏感性低、特異性差、難以檢測早期牛結(jié)核感染。IFN-γ作為Th1型細(xì)胞免疫效應(yīng)的主要指征在牛結(jié)核分枝桿菌感染早期分泌水平顯著升高，這為開發(fā)早期牛結(jié)核病的有效檢測試劑指明了方向。1990年Wood建立抗原特異性牛IFN-γ夾心ELISA方法用于牛結(jié)核病檢測，已在多國應(yīng)用，評價較好，有望替代傳統(tǒng)牛結(jié)核病檢測方法。但由于進(jìn)口試劑盒價格昂貴，難以在我國推廣，所以應(yīng)該著力開發(fā)我國自主知識產(chǎn)權(quán)的新型牛結(jié)核病檢測試劑盒。

3、本研究通過對本室研制的13株小鼠抗rHis-BoIFN-γ單克隆抗體(Monoclonal antibodies，McAb)進(jìn)行鑒定，篩選出3株針對天然牛IFN-γ的單抗，經(jīng)初步配對建立牛IFN-γ夾心ELISA檢測方法，但效果不佳。后將單抗與制備的兔抗rHis-BoIFN-γ多抗血清配對建立了牛IFN-γ抗原捕獲ELISA檢測方法，可有效檢測天然牛IFN-γ。初步臨床應(yīng)用顯示建立的方法檢測臨床樣本奶牛天然IFN-γ與進(jìn)口試劑盒符合率為

4、83.9％。這為進(jìn)一步開發(fā)牛IFN-γ ELISA試劑盒以及牛IFN-γ ELISPOT檢測方法奠定了基礎(chǔ)，也為我國牛結(jié)核病防控提供了一種有效檢測試劑。 1.抗牛IFN-γ單克隆抗體的鑒定 采用Dot-ELISA方法對13株單抗分別與rHis-BoIL-4、rGST-BoIL-4、rHis-BoIFN-γ、rGST-BoIFN-γ、rHis-ChIFN-γ、rHis-ChIL-4、rGST-ChIL-4，以及BL21(D

5、E3)(pET)和BL21(pGEX-6P-1)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的超聲波裂解液上清的反應(yīng)性進(jìn)行鑒定；通過Western-blot試驗鑒定單抗與重組菌BL21(DE3)(pET-BoIFN-γ)、BL21(DE3)(pET)全菌蛋白的反應(yīng)性；通過間接ELISA實驗證明13株單抗與商品化rBoIFN-γ反應(yīng)性，最終確定13株單抗均特異針對rBoIFN-γ而不與無關(guān)蛋白成分反應(yīng)。對體內(nèi)誘生的腹水效價進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)除單抗9G11，其余單抗腹水效價

6、都在1：80000以上。 2.牛IFN-γ抗原捕獲ELISA檢測方法的建立 采用辛酸-硫酸銨兩步法對體內(nèi)誘生的單抗腹水進(jìn)行純化獲得了純度高、生物活性好的純化抗體。采用相加ELISA實驗對單抗針對的抗原表位進(jìn)行鑒定，并對針對不同抗原表位的單抗6F8、1G5進(jìn)行生物素化，同時用HRP標(biāo)記單抗8D3。得到Biotinylated6F8效價為1:10000，HRP-8D3效價為1：3200。用本室保存的rHis-BoIFN-γ做

7、待檢抗原，單抗3E6/1C12與Biotinylated6F8直接配對建立了rBoIFN-γ雙抗體夾心ELISA檢測方法，靈敏度達(dá)0.5ng/mL，并能檢出1.6ng/mL商品化rBoIFN-γ，但檢測天然BoIFN-γ效果不佳。所以我們又建立了BoIFN-γ抗原捕獲ELISA檢測方法。 以rHis-BoIFN-γ做免疫原免疫兔子制備了兔抗rHis-BoIFN-γ多抗血清。用PWM刺激奶牛全血產(chǎn)生的天然BoIFN-γ篩選出與之反

8、應(yīng)的三株單抗5E11、6F8、8D3。將單抗5E11按照40μg/mL濃度包被與1：3000倍稀釋的兔抗rHis-BoIFN-γ多抗血清配對，以1：6000稀釋的商品化羊抗兔酶標(biāo)抗體做指示抗體建立牛IFN-γ抗原捕獲ELISA檢測方法，可有效檢測天然BoIFN-γ。 3.牛IFN-γ抗原捕獲ELISA檢測方法的初步應(yīng)用 用進(jìn)口試劑盒Mycobacterium bovis Gamma Interferon Test Kit

9、 for cattle對江蘇部分地區(qū)奶牛結(jié)核病做調(diào)查，期間檢測A地奶牛117頭，檢出禽結(jié)核陽性15例，可疑牛結(jié)核3例，未檢出陽性牛結(jié)核。檢測B地奶牛場奶牛59頭，檢出9例牛結(jié)核陽性，2例禽結(jié)核陽性，可疑牛結(jié)核10例。這在一定程度反應(yīng)出兩地牛結(jié)核病控制措施的差異。將獲得的部分臨床檢測血清樣本用牛IFN-γ抗原捕獲ELISA方法檢測，兩種方法檢測牛IFN-γ的符合率達(dá)到83.9％。 結(jié)果表明建立的牛IFN-γ抗原捕獲ELISA檢測方