γ-干擾素介導(dǎo)牛結(jié)核快速檢測(cè)方法的研究及初步應(yīng)用.pdf

1、牛結(jié)核病是由牛分枝桿菌所引起的一種人畜共患的慢性消耗性傳染病，人可因感染牛分枝桿菌而發(fā)生結(jié)核[1,2,3]，因此牛結(jié)核病不僅關(guān)系到畜牧業(yè)的持續(xù)發(fā)展，而且直接影響人類的健康[4，5]。國(guó)際上普遍采取“檢疫-撲殺”的措施控制該病的傳播。盡管有關(guān)牛結(jié)核檢測(cè)方法有多種，但快速、靈敏、特異的方法在我國(guó)還沒有建立，因此本研究通過研制的抗牛γ-干擾素單克隆抗體建立了牛IFN-γ競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA方法和膠體金免疫層析檢測(cè)牛結(jié)核IFN-γ方法。初步臨床應(yīng)

2、用顯示ELISA方法對(duì)臨床奶牛樣本IFN-γ的檢測(cè)結(jié)果與結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(Tuberculin Skin Test,TST)結(jié)果符合率為83.4％；膠體金免疫層析檢測(cè)結(jié)果與TST結(jié)果符合率為78.6％，膠體金免疫層析檢測(cè)結(jié)果與進(jìn)口試劑盒結(jié)果的符合率為85.7％，進(jìn)口試劑盒檢測(cè)結(jié)果與TST檢測(cè)結(jié)果符合率為78.6％。此結(jié)果為進(jìn)一步研究開發(fā)特異性和敏感性更高的牛IFN-γ的檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)，為我國(guó)牛結(jié)核病的防控提供了一種比較簡(jiǎn)便的檢測(cè)手段

3、。
　　 ㈠抗BoIFN-γ特異性單克隆抗體的研制及鑒定。
　　 利用大腸桿菌表達(dá)融合蛋白GST-BoIFN-γ的細(xì)菌裂解上清作為抗原免疫BALB/C小鼠，取其脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合，以表達(dá)GST-BoIFN-γ的大腸桿菌超聲波裂解物和表達(dá)GST的大腸桿菌超聲波裂解物分別作為包被抗原，通過間接ELISA方法平行篩選獲得了3株抗BoIFN-γ的單克隆抗體，分別命名為BoIFN-γ-5G7、BoIFN-γ-6G7和B

4、oIFN-γ-6D11。Western-blot試驗(yàn)證實(shí)，本研究所獲得的單克隆抗體均能與表達(dá)GST-BoIFN-γ融合蛋白的重組菌反應(yīng)，識(shí)別分子量為42kD特異性蛋白質(zhì)條帶，與表達(dá)GST的非重組菌不反應(yīng)；間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)結(jié)果證實(shí)，單抗能特異性識(shí)別Sf9細(xì)胞表達(dá)的重組BoIFN-γ，在熒光倒置顯微鏡下可見亮綠色熒光。捕獲ELISA方法進(jìn)行亞類鑒定結(jié)果表明，單抗6G7和5G7為IgG2a亞類，單抗6D11為IgM亞類。5G7單抗腹

5、水的效價(jià)可以達(dá)到1∶409600，細(xì)胞上清效價(jià)可達(dá)到1∶20000，6G7單抗腹水和細(xì)胞上清的效價(jià)分別為1∶204800和1∶4000，6D11單抗腹水和細(xì)胞上清的效價(jià)分別為1∶12800和1∶2560。中和試驗(yàn)結(jié)果表明，單抗6G7對(duì)大腸桿菌表達(dá)的rBoIFN-γ和桿狀病毒真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的rBoIFN-γ具有一定的中和作用。本研究所獲得的三株單抗為建立檢測(cè)BoIFN-γ的方法提供了條件。
　　 ㈡競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA檢測(cè)BoIF

6、N-γ方法的建立及初步應(yīng)用。
　　 用GST瓊脂糖凝膠FF柱純化大腸桿菌表達(dá)的重組GST-BoIFN-γ，按不同濃度梯度包被ELISA酶標(biāo)板，篩選最佳抗原包被濃度；用Hi-Trip Protein G柱純化單克隆抗體BoIFN-γ-6G7，測(cè)定最小飽和抗體量；然后將待檢樣品與定量的單克隆抗體BoIFN-γ-6G7作用后加入到包被抗原的ELISA酶標(biāo)板上，37℃濕盒進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，再與1∶10000稀釋的HRP標(biāo)記兔抗鼠酶標(biāo)抗體作用

7、并以底物顯色，建立了一種有效檢測(cè)奶牛天然IFN-γ競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA方法。
　　 用建立的該方法檢測(cè)北京臨床樣品23份和江蘇某奶牛場(chǎng)樣品30份，結(jié)果表明，北京樣品全部為陽(yáng)性，與進(jìn)口試劑盒檢測(cè)結(jié)果完全一致。江蘇某奶牛場(chǎng)30份樣品中有8份陽(yáng)性，3份可疑，其余為陰性，檢測(cè)結(jié)果與結(jié)核菌素皮內(nèi)試驗(yàn)符合率為83.4％。
　　 ㈢膠體金免疫層析檢測(cè)BoIFN-γ方法的建立及初步應(yīng)用。
　　 以檸檬酸三鈉法制備直徑為30nm左右

8、的膠體金溶液，調(diào)節(jié)pH值至8.3；以3.3μg/ml的單抗BoIFN-γ-6G7標(biāo)記膠體金，用10％BSA和10％PEG-20000穩(wěn)定膠體金溶液；離心后用PB稀釋液稀釋金標(biāo)復(fù)合物，噴玻璃纖維素膜；NC膜上分別以0.6μl/cm和0.8μl/cm的量噴C、T線，組裝試紙條。
　　 用試紙條對(duì)江蘇某奶牛場(chǎng)14份血樣進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果7份陽(yáng)性，3份可疑，4份陰性，與結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(TST)符合率為78.6％，試紙條檢測(cè)結(jié)果與進(jìn)口試劑盒