VCIP IRES介導的人溶菌酶與牛γ干擾素共表達腺病毒載體的構建及鑒定.pdf

1、內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)序列是一種能夠獨立招募核糖體以表達蛋白的雙順反子序列，在構建多基因共表達載體的過程中發(fā)揮著重要作用。溶菌酶(Lysozyme，LYZ)是一種能夠水解細胞壁內(nèi)粘多糖的堿性酶，具有很廣的抗菌譜，能夠溶解革蘭氏陽性細菌和部分革蘭氏陰性細菌，甚至病毒也有一定的滅活作用。牛γ-干擾素（BoIFN-γ）是細胞在受到適宜的刺激時，在特定的誘生劑作用下，分泌的一種微量的具有抗病毒、影響細胞生長分化、抗腫瘤，調(diào)節(jié)免疫功能的糖

2、蛋白。因此，LYZ與BoIFN-γ的聯(lián)合使用對于奶牛乳房炎的防治具有很高的利用價值。綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)是一種由238個氨基酸組成的具有獨特的發(fā)光機制的蛋白，最早發(fā)現(xiàn)于水母中，是新型的報告基因和定位標記物。腺病毒穿梭載體(Ad vector)因其外源基因表達效率高、瞬間表達，安全性好和易獲得高病毒滴度的載體等特點，在基因工程上受到了廣泛的應用。
　　為了獲得能高效表達人溶菌酶(

3、hLYZ)與牛γ干擾素（BoIFN-γ）的雙表達腺病毒載體，本實驗分別從人和鼠的基因組中克隆出人膠原誘導蛋白(hVCIP) IRES序列，命名為hIRES和鼠膠原誘導蛋白(mVCIP) IRES序列，命名為mIRES;從含有人溶菌酶基因(hLYZ)的pCDNAK-LYZ載體上PCR擴增出hLYZ序列;從含有GFP基因的pEGFP-N1載體上擴增出GFP序列。經(jīng)測序正確后，分別插入腺病毒穿梭載體Pshuttle-cmv的相應位點，構建獲得

4、Pshuttle-hLYZ-hIRES-GFP和Pshuttle-hLYZ-mIRES-GFP兩種重組腺病毒載體。用脂質體法分別轉染PK15、AAV293和牛腎細胞，經(jīng)熒光顯微鏡觀察和FACS檢測，結果顯示，兩種IRES均成功介導了下游基因GFP的表達，不同的細胞中，報告基因GFP的表達量存在較大差別。用BoIFN-γ替換GFP基因，獲得Pshuttle-hLYZ-mIRES-BoIFN重組腺病毒載體，在AAV-293細胞內(nèi)包裝成腺病毒