廣州管圓線蟲(chóng)感染免疫中ICOS-ICOSL通路及發(fā)育期蛋白的分析和研究.pdf

1、研究背景：廣州管圓線蟲(chóng)是一種人獸共患寄生蟲(chóng)。其幼蟲(chóng)階段可侵入非正常宿主——人，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病變。
　　在感染免疫中抗原由抗原提呈細(xì)胞(APC)處理成多肽，它與MHC結(jié)合并移至APC表面，產(chǎn)生活化TCR信號(hào)；而APC或靶細(xì)胞表面的共刺激分子與T淋巴細(xì)胞表面的有關(guān)受體結(jié)合就產(chǎn)生第二活化信號(hào)，即協(xié)同刺激信號(hào)。在雙信號(hào)刺激下，T淋巴細(xì)胞被激活后轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，并迅速增殖、分化。CD28-B7共刺激途徑是研究最早最深入的共刺激途徑之

2、一,但CD28并不是惟一的共刺激分子?？烧T導(dǎo)共刺激因子（inducible co-stimulator, ICOS）為CD28家族的新成員，主要表達(dá)于活化的 T細(xì)胞；其配體ICOSL主要表達(dá)于B細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和T細(xì)胞。
　　此外，寄生蟲(chóng)需要通過(guò)改變宿主來(lái)完成其生活史，因此，他們有根據(jù)宿主環(huán)境來(lái)調(diào)節(jié)基因的差異表達(dá)的能力。廣州管圓線蟲(chóng)生活史的完成需要幾個(gè)不同的宿主。Ⅲ期幼蟲(chóng)（L3）感染大鼠后，穿過(guò)血腦屏障發(fā)展成Ⅴ期幼蟲(chóng)（L

3、5），再移行至心、肺部血管內(nèi)發(fā)育成成蟲(chóng)。
　　本研究首先應(yīng)用ICOSL-KO和C57BL/6J兩種小鼠建立廣州管圓線蟲(chóng)感染的模型，觀察ICOS-ICOSL信號(hào)通路在廣州管圓線蟲(chóng)感染免疫調(diào)節(jié)中的意義；其次，運(yùn)用雙向熒光差異凝膠電泳和質(zhì)譜相結(jié)合的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析鑒定廣州管圓線蟲(chóng)發(fā)育期特異性蛋白質(zhì)并分析他們?cè)谒拗?寄生蟲(chóng)相互作用中的意義。本研究結(jié)果可為廣州管圓線蟲(chóng)感染的發(fā)展和消退研究提供新的思路，還為廣州管圓線蟲(chóng)病的治療提供可能性靶標(biāo)

4、。
　　第一部分 ICOS-ICOSL信號(hào)通路在廣州管圓線蟲(chóng)感染免疫調(diào)節(jié)中的意義
　　目的：通過(guò)觀察兩種廣州管圓線蟲(chóng)感染宿主模型（ICOSL-KO和C57BL/6J）血清抗體、脾淋巴細(xì)胞表面協(xié)同刺激因子及脾淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)變化，探索ICOS-ICOSL信號(hào)在廣州管圓線蟲(chóng)感染免疫調(diào)節(jié)中的意義。
　　方法：實(shí)驗(yàn)室條件下構(gòu)建廣州管圓線蟲(chóng)感染的ICOSL-KO和C57BL/6J小鼠模型。分別于感染前、感染后1周、2周

5、、3周、4周，分批處死小鼠每批每組各取5只小鼠，眼眶取血，收集血清，ELISA法測(cè)定血清中IgG、IgG1和IgG2a的水平。同時(shí)分離不同感染時(shí)期小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀測(cè)定CD4+T淋巴細(xì)胞上CD28、CD154和ICOS的表達(dá)，其結(jié)果用SPSS17.0采用t檢驗(yàn)和F檢驗(yàn)分析其統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。體外培養(yǎng)脾CD4+T淋巴細(xì)胞。加入廣州管圓線蟲(chóng)L5可溶性抗原干預(yù)共刺激信號(hào)。培養(yǎng)72小時(shí)后，收集細(xì)胞上清。ELISA法測(cè)定上清中IFN-γ、I

6、L-12、IL-4、IL-5和IL-13等細(xì)胞因子表達(dá)水平。
　　結(jié)果：ICOSL-KO組與C57BL/6J組在感染后均表現(xiàn)為IgG抗體水平的升高；前者IgG1水平在感染后升高不顯著，但后者的IgG1水平相對(duì)在感染后3W開(kāi)始出現(xiàn)升高，4W時(shí)仍維持升高；同時(shí)C57BL/6J小鼠的IgG2a水平在感染后升高不顯著，并于3W開(kāi)始出現(xiàn)下降，反觀ICOSL-KO小鼠IgG2a水平在感染后3W開(kāi)始出現(xiàn)升高，4W時(shí)仍保持升高狀態(tài)。ICOSL-K

7、O組與C57BL/6J組相比IgG1動(dòng)態(tài)趨勢(shì)及IgG2a水平升高趨勢(shì)，顯示ICOS-ICOSL信號(hào)通路的阻斷通過(guò)抑制Th2的極化使宿主無(wú)法組織產(chǎn)生有效的體液保護(hù)性免疫，ICOSL-KO小鼠表現(xiàn)為T(mén)h1的的免疫類型占優(yōu)勢(shì)。感染后ICOSL-KO組的CD4+T淋巴細(xì)胞上協(xié)同刺激分子產(chǎn)生也明顯滯后，感染后3W才出現(xiàn)顯著性差異；C57BL/6組針對(duì)廣州管圓線蟲(chóng)急性感染，感染后1W即出現(xiàn)顯著性差異。C57BL/6J組感染早期出現(xiàn)IFN-γ、IL-

8、12增高現(xiàn)象，而后下降，提示感染2W內(nèi)Th1免疫應(yīng)答水平占優(yōu)勢(shì)，隨之逐漸被Th2免疫應(yīng)答水平取代；而ICOSL-KO組Th1型細(xì)胞因子IFN-γ、IL-12的早期不增高，表明ICOS-ICOSL信號(hào)通路也參與到感染免疫早期的Th1型免疫的活化過(guò)程。在感染早期Th2型細(xì)胞因子IL-4和IL-5受ICOS-ICOSL信號(hào)通路影響不大。IL-13在C57BL/6J小鼠感染后3W后出現(xiàn)增高， IL-13在ICOSL-KO小鼠出現(xiàn)延后升高，兩種動(dòng)

9、物感染模型動(dòng)態(tài)檢測(cè)的顯著性差異，也說(shuō)明了ICOS-ICOSL通路阻斷對(duì)Th2型免疫應(yīng)答水平的調(diào)控作用。
　　結(jié)論：在廣州管圓線蟲(chóng)的急性感染期，Th2型的免疫方式在免疫應(yīng)答過(guò)程中占優(yōu)勢(shì)；ICOS-ICOSL通路調(diào)節(jié)作用既能延遲Th2免疫反應(yīng)的進(jìn)行，也具有調(diào)節(jié)Th1型免疫活化的能力。
　　第二部分基于2D-DIGE的廣州管圓線蟲(chóng)發(fā)育期特異性差異蛋白研究
　　目的：通過(guò)研究廣州管圓線蟲(chóng)期特異性差異蛋白，可以為宿主環(huán)境在寄生蟲(chóng)

10、發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控或宿主-寄生蟲(chóng)相互作用中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：實(shí)驗(yàn)室條件下建立廣州管圓線蟲(chóng)生活史，分別于感染的不同時(shí)期收集廣州管圓線蟲(chóng)L3、FL5、ML5、FA和MA。將收集的蟲(chóng)體分別使用裂解液裂解、超聲裂解、離心，獲得的上清，使用Bio-Rad protein assay reagent測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。分別用Cy3或Cy5標(biāo)記樣品，Cy2標(biāo)記內(nèi)標(biāo)。進(jìn)行雙向熒光差異凝膠電泳，并利用UMax Powerlook211

11、0XL和Typhoon FLA9000對(duì)電泳后的膠板圖像掃描，得到不同顏色的掃描圖。采用DeCyder7.0圖像分析篩選差異表達(dá)蛋白譜，繼而對(duì)候選蛋白點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF-MS鑒定、數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。用Real-time PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果：雙向熒光差異凝膠電泳得到了清晰的蛋白質(zhì)表達(dá)譜。蛋白表達(dá)差異值經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(t檢驗(yàn))，篩選出在24張圖譜中均出現(xiàn)的點(diǎn)共183個(gè)蛋白點(diǎn)。5點(diǎn)在L5中上調(diào)，而在成蟲(chóng)期下調(diào)且沒(méi)有表現(xiàn)出顯著的

12、性別差異；與L3比，89個(gè)蛋白點(diǎn)在成蟲(chóng)和L5中上調(diào)，而13個(gè)蛋白點(diǎn)在L3中出現(xiàn)明顯上調(diào)；另一方面，實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)有些性別差異表達(dá)的蛋白，雌雄成蟲(chóng)比對(duì)中，12個(gè)蛋白點(diǎn)在MA中表達(dá)上調(diào)而7個(gè)蛋白點(diǎn)在FA中表達(dá)上調(diào)；L5中各有3個(gè)蛋白在FL5、ML5中表達(dá)上調(diào)，還有點(diǎn)1496在MA和ML5均表達(dá)增加，表現(xiàn)為性別特異性。
　　質(zhì)譜鑒定80個(gè)點(diǎn)，成功鑒定了其中37個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，29個(gè)點(diǎn)是功能蛋白，從細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白到參與代謝過(guò)程、免疫反應(yīng)和轉(zhuǎn)錄