廣州管圓線蟲感染小鼠腦組織cathepsins表達(dá)變化及AcHTCP基因的克隆.pdf

1、廣州管圓線蟲?。ˋngiostrongyliasis cantonensis）是由廣州管圓線蟲Angiostrongylus cantonensis(Ac)引起的以中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥為主的食源性寄生蟲病。軟體動物螺類，如非洲大蝸牛Achatina fulica(Ferussac，1821)、福壽螺Pomacea canaliculata(Lamarck，1819)是Ac中間宿主、大鼠是Ac的終宿主、人和小鼠等是其非適宜宿主。人多因生食含有

2、三期幼蟲的淡水螺肉而感染。
　　廣州管圓線蟲病主要在東南亞和太平洋島嶼流行。自1945年臺灣首例報道之后，國內(nèi)也陸續(xù)出現(xiàn)新發(fā)病例報道，而且在浙江和北京均出現(xiàn)大規(guī)模爆發(fā)流行，我國衛(wèi)生部于2003年將廣州管圓線蟲病列為新發(fā)傳染病。目前，臨床上廣州管圓線蟲病主要診斷依據(jù)包括三個方面:接觸史、臨床癥狀和ELISA檢測結(jié)果。從感染患者腦脊液中檢測到蟲體是診斷此病的金標(biāo)準(zhǔn)，盡管此方法結(jié)果可靠，但是檢出率很低，而且是侵襲性檢查，因此難以普及，臨

3、床上也少見使用。實驗室最常采用的診斷方法是ELISA法（檢測患者血清特異性抗體），但用于ELISA法的抗原是蟲體粗抗原，不但敏感性和特異性有待提高，也無法用于療效考核。因此，尋找具有診斷價值的生物標(biāo)記物對于改進(jìn)和完善廣州管圓線蟲病的診斷方法具有重要意義。
　　從已有的研究中不難發(fā)現(xiàn)，在寄生蟲感染宿主過程中，宿主和寄生蟲的組織蛋白酶均發(fā)揮重要作用。小鼠組織蛋白酶亞型眾多，搜索Pubmed數(shù)據(jù)庫可得到18種組織蛋白酶亞型，即是:Cat

4、hepsin A，B，C，D，E，F(xiàn),G,H，J，K，L，M，O，Q，R，S，W,Z。通過對有關(guān)宿主組織蛋白酶文獻(xiàn)的分析，推測小鼠組織蛋白酶可能參與寄生蟲感染所致腦炎的過程。
　　從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得廣州管圓線蟲血紅蛋白型半胱氨酸蛋白酶(Angiostrongylus cantonensis hemoglobinase-type cysteine proteinase GenBank號碼:HQ110101.1)基因序列。研

5、究發(fā)現(xiàn)蟲源性組織蛋白酶與寄生蟲的宿主入侵、自身保護(hù)和免疫逃避相關(guān)。
　　本研究分兩個部分:①感染BALB/c小鼠腦部組織蛋白酶各亞型的表達(dá)譜及變化規(guī)律研究;②廣州管圓線蟲血紅蛋白型半胱氨酸蛋白酶基因的克隆。
　　第一部分感染小鼠腦部組織蛋白酶各亞型的表達(dá)譜及其變化規(guī)律研究
　　研究目的:
　　研究BALB/c小鼠Ac感染模型，動態(tài)觀察感染BALB/c小鼠組織蛋白酶亞型的表達(dá)譜及表達(dá)譜的變化。為進(jìn)一步尋找到可作為診

6、斷廣州管圓線蟲病的生物標(biāo)記物(biomarker)提供實驗基礎(chǔ)。
　　研究內(nèi)容和方法:
　　1.在GenBank中查找小鼠不同亞型組織蛋白酶家族基因序列信息。
　　2.通過網(wǎng)站https://www.genscript.com/ssl-bin/app/primer，分別設(shè)計小鼠組織蛋白酶18個亞型（包括:cathepsinA，B，C，D，E，F(xiàn),G,H，J，K，L，M，O，Q，R,S，W,Z）的實時熒光定量PCR(Re

7、al-time PCR)引物。
　　3.建立感染廣州管圓線蟲病的BALB/c小鼠動物模型，收集感染不同時點(7d、14d、21d)的腦組織，用Real-time PCR檢測分析小鼠感染后各種亞型基因的表達(dá)情況。
　　研究結(jié)果:
　　1.在GenBank數(shù)據(jù)庫中共發(fā)現(xiàn)小鼠組織蛋白酶18個亞型，包括:cathepsinA,B,C,D,E,F,G,H,J,K,L,M,O,Q,R,S,W, Z。
　　2.建立感染廣州管圓

8、線蟲病BALB/c小鼠模型，通過對感染過程腦組織組織蛋白酶各亞型的表達(dá)水平的檢測，發(fā)現(xiàn)不同亞型組織蛋白酶表達(dá)呈現(xiàn)三種變化趨勢:逐步上升型（(C)、E、S、Z）、陡然上升型(Cathepsin G、 K、 L、 M、Q、R)及不規(guī)則變化型（Cathepsin J）。
　　小結(jié):
　　本次研究結(jié)果表明，感染廣州管圓線蟲病后，BALB/c小鼠的組織蛋白酶各亞型的表達(dá)水平發(fā)生變化，大多數(shù)組織蛋白酶亞型出現(xiàn)表達(dá)水平的升高。分析結(jié)果提示

9、，小鼠組織蛋白酶S、C和M型具有進(jìn)一步的研究意義。
　　第二部分廣州管圓線蟲的血紅蛋白型半胱氨酸蛋白酶基因的克隆
　　研究目的:
　　對廣州管圓線蟲血紅蛋白型半胱氨酸蛋白酶(AcHTCP)基因進(jìn)行克隆和初步表達(dá)，為后續(xù)進(jìn)一步研究此蛋白酶的免疫學(xué)功能做準(zhǔn)備。
　　研究內(nèi)容和方法:
　　1.從GenBank中查找到AcHTCP序列信息，并對序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
　　2.按常規(guī)方法，構(gòu)建pET32a(+