廣州管圓線蟲幼蟲入侵小鼠血腦屏障與細胞凋亡相關性.pdf

1、目的： 1.體內(nèi)實驗：構建廣州管圓線蟲幼蟲實驗感染ICR小鼠動物模型，采用HE染色、脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL)及Western-blot方法逐步檢測其腦組織細胞凋亡情況。 2.體外實驗：經(jīng)原代分離、純化、鑒定培養(yǎng)出ICR小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞和星型膠質(zhì)細胞并建立血腦屏障細胞模型；廣州管圓線蟲幼蟲提取液作用血腦屏障細胞模型后觀測其功能損傷；檢測廣州管圓線蟲幼蟲提取液誘導血腦屏障細胞凋亡情況。探

2、討廣州管圓線蟲幼蟲入侵小鼠血腦屏障與細胞凋亡相關性。 方法： 1.體內(nèi)實驗： (1)構建廣州管圓線蟲幼蟲實驗感染ICR小鼠動物模型。 (2)取正常ICR小鼠和廣州管圓線蟲幼蟲實驗感染ICR小鼠的腦組織，做石蠟切片行HE染色初步觀察感染鼠和實驗鼠腦組織細胞形態(tài)學變化。 (3)脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL)觀察廣州管圓線蟲幼蟲實驗感染ICR小鼠的大腦、小腦、腦干的細胞凋亡情

3、況并計算細胞凋亡率。 (4)Western-blot方法檢測廣州管圓線蟲幼蟲感染第10天、13天、15天、17天的ICR小鼠腦組織內(nèi)凋亡蛋白Caspase3的變化情況。 2.體外實驗： (1)原代培養(yǎng)方法分離、純化和鑒定ICR小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞和星型膠質(zhì)細胞。 (2)將培養(yǎng)好的兩種細胞在0.4μm孔徑的細胞培養(yǎng)插多孔濾膜(transwell)上下兩側進行共培養(yǎng)，通過滲濾實驗和通透性實驗鑒定其符合在體狀態(tài)

4、血腦屏障特征。 (3)取廣州管圓線蟲幼蟲及其提取液作用于已構建好的血腦屏障細胞模型，觀察對其滲濾和通透性的影響。用cck-8法檢測廣州管圓線蟲幼蟲提取液對前述原代培養(yǎng)的小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞和星型膠質(zhì)細胞的生長抑制作用濃度，進而用TUNEL和Annexin-v-FITC/PI細胞雙染方法檢測廣州管圓線蟲幼蟲提取液致腦微血管內(nèi)皮細胞和星型膠質(zhì)細胞凋亡情況。 結果： 1.體內(nèi)實驗： (1)感染廣州管圓線蟲幼蟲的

5、小鼠腦組織切片經(jīng)HE染色后光鏡下進行初步組織形態(tài)學觀察，正常對照鼠腦細胞切片細胞形態(tài)一致，細胞核完整染成均一藍色，而感染鼠腦組織切片中細胞胞體變小變圓，有核固縮、深染現(xiàn)象。 (2)TUNEL結果顯示感染廣州管圓線蟲幼蟲的ICR小鼠大腦、小腦、腦干組織均有細胞凋亡發(fā)生，細胞凋亡率分別為20％、50％和70％。 (3)Western-blot結果顯示隨著廣州管圓線蟲幼蟲感染ICR小鼠的感染時間的延長，感染鼠腦組織的活性Cas

6、pase3量遞增，全長Caspase3量遞減，表明組織細胞凋亡的程度逐步增加。 2.體外實驗： (1)經(jīng)原代分離、純化、鑒定出ICR小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞和星型膠質(zhì)細胞并成功構建血腦屏障細胞模型。 (2)將廣州管圓線蟲幼蟲及其提取液作用于血腦屏障細胞模型后可引起其滲濾和通透性增加，導致其屏障功能損傷。 (3)TUNEL和Annexin-v-FITC/PI細胞雙染結果證實廣州管圓線蟲幼蟲提取液可致原代培養(yǎng)的I