剛地弓形蟲ADF基因的生物信息學分析、克隆表達及免疫保護性研究.pdf

1、實驗目的
　　對剛地弓形蟲肌動蛋白解聚因子（TgADF）基因進行生物信息學分析，并對該基因進行克隆、表達，表達產物純化后分析其抗原性；觀察重組弓形蟲肌動蛋白解聚因子（rTgADF）免疫小鼠誘導的黏膜及系統(tǒng)免疫應答和抗弓形蟲感染的能力，探討rTgADF作為弓形蟲候選疫苗的可能性。
　　實驗方法
　　第一部分：對TgADF的主要特性及抗原表位進行生物信息學分析。利用蛋白分析專家系統(tǒng)（ExPASy）提供的ProtParam、

2、SOSUI、TMHMM、SOPMA、MotifScan、SWISS-MODEL，NCBI上的Bcepred等生物信息學在線分析程序，結合DNAMAN生物信息學軟件，分析、預測TgADF蛋白的理化性質、可溶性、表面可及性﹑跨膜區(qū)，翻譯后修飾位點、親（疏）水性、二級結構、抗原表位、三維模型等。
　　第二部分：構建重組質粒pET30a（+）-TgADF，并在大腸桿菌中高效表達。對表達的rTgADF蛋白進行純化及免疫原性分析。收集、純化R

3、H株弓形蟲速殖子，提取總RNA；設計合成引物并引入BamHI和XhoI酶切位點，RT-PCR擴增編碼TgADF的基因片段克隆到原核表達質粒pET30a（+）中，經雙酶切、PCR及測序鑒定陽性克隆；重組質粒pET30a（+）-TgADF在大腸桿菌BL21(DE3)中用IPTG誘導表達，表達產物經SDS-PAGE進行鑒定。大量表達rTgADF，以Ni-NTA層析法純化蛋白，用His標簽抗體及兔抗弓形蟲血清做Westernblotting分析

4、。
　　第三部分：觀察不同劑量rTgADF滴鼻免疫小鼠誘導的黏膜和系統(tǒng)免疫應答。BALB/c小鼠40只隨機分為5組，免疫組分別用10μg、20μg、30μg、40μgrTgADF/只滴鼻免疫小鼠，免疫3次，分別于第0、14、21天各一次，rTgADF溶于20μlPBS中，對照組用等量PBS滴鼻。末次免疫后第14d，頸椎脫臼處死小鼠，ELISA法檢測腸液、鼻咽沖洗液及膀胱沖洗液的sIgA和血清IgG。分離培養(yǎng)脾淋巴細胞，CCK-8法

5、測定其刺激指數(shù)并收集培養(yǎng)上清，ELISA法測定上清中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10含量。綜合多項指標確定最佳免疫劑量。
　　第四部分：觀察30μgrTgADF滴鼻免疫小鼠誘導的免疫保護性。BALB/c小鼠60只隨機分為2組，用30μgrTgADF溶于20μlPBS中免疫小鼠3次，分別于第0、14、21天各一次，對照組用等量PBS滴鼻。末次免疫后第14d，末次免疫后第14d，分別用1×104個速殖子（慢性感染，免疫組和對

6、照組各8只）或4×104個速殖子（急性感染，免疫組和對照組各22只）/只灌胃攻擊小鼠。30d后頸椎脫臼處死慢性感染后小鼠，計數(shù)肝、腦組織內弓形蟲速殖子，并觀察記錄急性感染小鼠健康狀況及其存活情況。
　　實驗結果
　　通過生物信息學分析，剛地弓形蟲ADF有4個表面可及性參數(shù)≥1.9的區(qū)域、1個柔韌性參數(shù)得分≥2的區(qū)域、5個翻譯后修飾位點、7個潛在抗原表位，可能具有免疫原性，成為弓形蟲候選疫苗。
　　以RH株弓形蟲速殖子c

7、DNA為摸板，擴增獲得357bp的TgADF基因片段，并成功構建重組質粒pET30a（+）-TgADF；IPTG誘導后經SDS-PAGE分析，結果表明目的基因在大腸桿菌BL21（DE3）中高效表達，相對分子量（Mr）約20kDa。Westernblotting顯示，純化后的rTgADF能被抗His標簽抗體及兔抗弓形蟲免疫血清識別。
　　30、40μg組小腸、鼻咽及膀胱沖洗液sIgA含量顯著高于對照組（F值分別為18.260、17.

8、200；20.220、16.310；14.820、14.215，P<0.01），30μg組最高；30、40μg組血清IgG水平顯著高于對照組（F值分別為22.270,24.103,P<0.01），40μg組最高。與對照組比較，rTgADF刺激后，30、40μg組SI均增高（F值分別為7.272、5.433，P<0.05），ConA刺激后SI增高無統(tǒng)計學意義。30、40μg組培養(yǎng)上清IFN-γ、IL-2含量與對照組比較均增高（F值分別為2

9、6.917、24.115；18.860、16.205，P＜0.01），30μg組最高；20、30、40μg組的IL-4含量高于對照組（F值分別為6.252、7.328、7.115，P＜0.05），組間差別無統(tǒng)計學意義；IL-10含量，與對照組相比并未增高。綜合以上指標，確定30μg為較佳免疫劑量。
　　1×104個弓形蟲速殖子/只灌胃攻擊后，免疫組小鼠肝內蟲荷（13.89±1.2733×105/g）低于對照組（43.09±3.03

10、32×105/g），P＜0.01，減蟲率為67.77％；免疫組小鼠腦內蟲荷（6.33±0.4272×105/g）低于對照組（12.92±3.3030×105/g），P＜0.05，減蟲率為51.01%。4×104個速殖子/只灌胃攻擊，小鼠出現(xiàn)豎毛、倦怠、活動及飲食減少等表現(xiàn)，30d后對照組小鼠無存活，免疫組小鼠存活4只。
　　結論
　　生物信息學分析可知，剛地弓形蟲ADF存在7個潛在抗原表位，可能具有免疫原性。成功構建重組質粒