剛地弓形蟲蘋果酸脫氫酶基因的生物信息學分析、克隆表達及免疫保護性研究.pdf

1、目的:對剛地弓形蟲蘋果酸脫氫酶(TgMDH)基因進行生物信息學分析，并對該基因進行克隆和表達，純化表達產(chǎn)物，分析其免疫原性;觀察重組弓形蟲蘋果酸脫氫酶蛋白(rTgMDH)免疫小鼠誘導的黏膜及系統(tǒng)免疫應答及其抗弓形蟲感染作用，探討rTgMDH作為弓形蟲疫苗候選抗原的可能性。
　　方法:(1)對TgMDH基因的主要特性及抗原表位進行生物信息學分析。利用蛋白分析專家(ExPASy)提供的ProtParam、SOSUI、TMPRED、HN

2、N、MotifScan,NCBI上的ORF finder、Bcepred等生物信息學在線分析程序，結合Gene Runner、DNAMAN等生物信息學軟件，分析、預測TgMDH蛋白的理化性質(zhì)、可溶性、表面可及性、可塑性跨膜區(qū)翻譯后修飾位點、親（疏）水性、二級結構、抗原表位，通過SWISS-MODLE軟件預測該蛋白的三維結構。(2)構建重組質(zhì)粒pET30a(+)-TgMDH，并在大腸桿菌中高效表達可溶性蛋白。對原核表達的rTgMDH進行純

3、化及免疫原性分析。收集、純化RH株弓形蟲速殖子，提取總RNA;設計合成引物并引入EcoRI和Xho I酶切位點，RT-PCR擴增編碼TgMDH的基因片段克隆到原核表達載體pET30a(+)中，用雙酶切、PCR及測序鑒定陽性克隆。在大腸桿菌BL21(DE3)中用IPTG誘導表達，以SDS-PAGE鑒定表達產(chǎn)物。以鎳離子親和層析柱對大量表達的rTgMDH進行純化，以小鼠抗rTgMDH血清和兔抗弓形蟲血清作為一抗，經(jīng)Western blot分

4、析其抗原性。(3)觀察不同劑量rTgMDH滴鼻免疫小鼠誘導的黏膜和系統(tǒng)免疫應答。BALB/c小鼠40只隨機分為5組，分別用10μg、20μg、30μg、40μg rTgMDH/只滴鼻免疫BALB/c小鼠，免疫3次，一免與二免間隔14d，二免與三免間隔7d。rTgMDH溶于20μlPBS中，對照組用等量PBS滴鼻。末次免疫后14d，摘眼球采血，分離血清，采集小腸、鼻咽和膀胱沖洗液。ELISA法測定上述3種沖洗液中抗rTgMDH sIgA和

5、IgG及血清中抗rTgMDHIgA和IgG。分離脾淋巴細胞并培養(yǎng)，ELISA法測定培養(yǎng)24h脾淋巴細胞培養(yǎng)液上清中IL-2、IL-4、IL-10和培養(yǎng)96h培養(yǎng)液上清中IFN-γ。(4)觀察30μg rTgMDH滴鼻免疫小鼠誘導的抗弓形蟲感染作用。BALB/c小鼠60只，隨機分為免疫組和對照組，每組30只。各組內(nèi)慢性感染小鼠8只，急性感染小鼠22只。用30μgrTgMDH溶于20μl PBS中滴鼻免疫對照組小鼠3次，對照組用等量PBS滴

6、鼻。末次免疫后第14d，分別用8×104速殖子/只和9×105速殖子/只灌胃感染小鼠，觀察慢性感染和急性感染時小鼠的健康及存活狀況。攻擊感染后一個月，計數(shù)小鼠肝、腦組織內(nèi)弓形蟲速殖子數(shù)。
　　結果:(1)生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，剛地弓形蟲MDH有9個表面可及性參數(shù)≥1.9的區(qū)域、4個親水性參數(shù)≥1.9的區(qū)域、7個柔韌性參數(shù)≥2的區(qū)域、14個翻譯后修飾位點、14個潛在抗原表位，可能具有免疫原性。(2)以RH株弓形蟲速殖子的cDNA為模板

7、，擴增獲得951 bp的TgMDH基因片段，并成功構建重組質(zhì)粒pET30a(+)-TgMDH; IPTG誘導后經(jīng)SDS-PAGE分析表明，目的基因在大腸桿菌BL21中高效表達，相對分子量約36 kDa。Western blot顯示，純化后的rTgMDH能被小鼠抗rTgMDH血清和兔抗弓形蟲血清識別，具有抗原性。(3)不同劑量rTgMDH滴鼻免疫小鼠，均不同程度誘導了小鼠特異性免疫應答。與對照組相比，免疫組小鼠的血清sIgA及鼻咽沖洗液、

8、膀胱沖洗液和小腸沖洗液IgA水平高于對照組，具有統(tǒng)計學意義(F=12.773，P＜0.01; F=33.41，P＜0.01;F=9.289,P＜0.01;F=5.877，P＜0.01);免疫小鼠的IgG水平高于對照組，其中血清、鼻咽沖洗液和膀胱沖洗液IgG水平差異具有統(tǒng)計學意義(F=6.935，P＜0.01; F=28.386，P＜0.01;F=8.061，P＜0.01)，尤以30μg、40μg組顯著。各免疫組小腸沖洗液IgG水平與對照

9、組相比均無無統(tǒng)計學意義。免疫組小鼠脾淋巴細胞培養(yǎng)上清細胞因子增加，與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學意義(IL-2;F=43.967，P＜0.01;IL4:F=7.28,P＜0.01;IL-10:F=12.91，P＜0.01)，尤以30μg組顯著。免疫組IFN-γ水平增高，與對照組相比，也具統(tǒng)計學意義(F=3.063，P＜0.05)，尤以30μg、40μg組顯著。30μg組可以更有效地誘導黏膜和系統(tǒng)免疫應答。(4)經(jīng)30μg rTgMDH滴

10、鼻免疫的小鼠在攻擊感染后第7天，出現(xiàn)豎毛、倦怠、活動減少、飲水及采食減少。在急性感染組，免疫小鼠的存活率為52.38％，對照組存活率為31.82％，慢性感染小鼠則全部存活。免疫組小鼠肝組織內(nèi)蟲荷（速殖子數(shù)）低于對照組（F=24.98，F(xiàn)=46.249，P＜0.01）。
　　結論:(1)生物信息學分析發(fā)現(xiàn)剛地弓形蟲MDH有14個潛在的抗原表位，可能具有免疫原性。(2)成功構建重組質(zhì)粒pET30a(+)-TgMDH，并在大腸桿菌中高效