蘋果酸合成酶Glcb基因克隆及表達(dá)特性研究.pdf

1、結(jié)核病（tuberculosis）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）引起的慢性傳染性疾病，結(jié)核桿菌被巨噬細(xì)胞吞噬后，在巨噬細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)為持留狀態(tài)，通過乙醛酸循環(huán)途徑獲取能量，維持其在宿主體內(nèi)的長(zhǎng)期持留存在。蘋果酸合成酶（Malate Synthase，MS）是一由GlcB基因編碼而成，在乙醛酸循環(huán)途徑中的關(guān)鍵限速酶之一，對(duì)結(jié)核桿菌維持其持留狀態(tài)起決定性作用，因此本研究以這一關(guān)鍵酶為研究對(duì)象。
　　

2、本文以結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組為模板，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增該菌株的GlcB基因，并將測(cè)序正確的GlcB基因，克隆入原核表達(dá)載體pET-28a（+）中，取名為pET28-glcb。重組蘋果酸合成酶在大腸桿菌BL21（DE3）中進(jìn)行表達(dá)。本研究成功克隆表達(dá)了結(jié)核分枝桿菌H37Rv蘋果酸合成酶酶基因，最佳的誘導(dǎo)表達(dá)條件確定為在溫度為20℃，IPTG終濃度為0.6mM，誘導(dǎo)表達(dá)8h，GlcB蛋白表達(dá)量達(dá)到最大。以鎳離子螯合型瓊脂糖凝膠親和層析

3、柱純化異檸檬酸裂解酶重組蛋白，以含200mmol/L咪唑的洗脫緩沖液將目的蛋白洗脫下來，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，獲得了純度較高的MS重組蛋白。采用超微量分光光度計(jì)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)418nm處光吸收值的變化來計(jì)算MS的酶活性。最終計(jì)算結(jié)果酶活性為6.6μmol/(min·mg)。
　　同時(shí)，采用Discovery Studio2.1模擬多肽與MS蛋白晶體（3S9I）進(jìn)行分子對(duì)接，最終對(duì)接結(jié)果確定以下兩條七肽鏈，命名及氨基酸序列分別為：3號(hào)：