Ectoine合成酶基因重組表達(dá)研究.pdf

1、某些微生物在環(huán)境滲透壓脅迫下合成滲透壓補(bǔ)償溶質(zhì),Ectoine(四氫嘧啶,1,4,5,6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸,1,4,5,6-tetrahydro-2-methyl-4-pyrimdine carboxylicacid)是細(xì)菌中分布最廣泛的滲透壓補(bǔ)償溶質(zhì)之一。Ectoine在脫水、輻射、冷凍等逆環(huán)境下非特異性的保護(hù)細(xì)胞、蛋白質(zhì)、核酸等生物及生物大分子活力的特性。目前Ectoine已經(jīng)用于護(hù)膚品中的保濕劑,在許多商業(yè)中,比如酶的

2、穩(wěn)定劑、微生物的保護(hù)劑、化療中健康細(xì)胞的保護(hù)劑等,也都在研發(fā)中。目前Ectoine由細(xì)菌發(fā)酵制備,因?yàn)镋ctoine是胞內(nèi)物質(zhì),受胞內(nèi)濃度閾值限制,產(chǎn)量低,成本高,是工業(yè)化生產(chǎn)的技術(shù)瓶頸。
　　 為了提高Ectoine的制備效率,本文擬采用基因工程技術(shù)異源表達(dá)Cobetiamarina的Ectoine合成酶基因ectABC,并考察表達(dá)條件對Ectoine表達(dá)量的影響。采用步移PCR方法擴(kuò)增C.marina的ectABC；構(gòu)建ec

3、tABC表達(dá)載體PpET／ect和pET／ect,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coli BL21中,通過抗生素抗性篩選、ectABC基因PCR鑒定、Ectoine合成表型鑒定,獲得ectABC重組子；考察重組方式和重組子誘導(dǎo)表達(dá)條件對Ectoine表達(dá)量的影響。
　　 C.marina的Ectoine合成酶基因ectABC由558 bp、1263 bp和393 bp組成的三個開放閱讀框架組成,它們共用一個啟動子Pect。C.marina的

4、ectABC基因和表達(dá)載體pET43.1a通過限制性內(nèi)切酶BamHⅠ／SalⅠ切割并用T4 DNA片段連接試劑盒連接,分別獲得了攜有和沒有Pect的重組表達(dá)載體PpET／ect和pET／ect。重組表達(dá)載體PpET／ect和pET／ect分別轉(zhuǎn)化至E.coli BL21中,獲得了ectABC重組子PpET／ect／BL06和pET／ect／BL22?？疾熘亟M子PpET／ect／BL06和pET／ect／BL22誘導(dǎo)表達(dá)條件對Ectoin

5、e合成的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,C.marina ectABC轉(zhuǎn)化E.coliBL21,在特定的誘導(dǎo)條件下能夠表達(dá)Ectoine。NaCl濃度為1％時,當(dāng)培養(yǎng)基中存在其它滲透壓補(bǔ)償溶質(zhì)時,重組子PpET／ect／BL06和pET／ect／BL22能夠生長,但是自身不合成Ectoine；不加IPTG、Lac啟動子不工作,NaCl作為誘導(dǎo)物誘導(dǎo)表達(dá)時,ectABC基因的上游啟動子Pect啟動Ectoine誘導(dǎo)表達(dá),但是表達(dá)量較Lac啟動子與Pe