紫蘇迷迭香酸合成酶基因克隆與表達(dá)分析研究.pdf

1、本研究以唇形科植物紫蘇(Perillafrutescens)做為研究對(duì)象，采用cDNA末端快速擴(kuò)增(RapidamplificationofcDNAends，RACE)技術(shù)，首次從紫蘇中克隆到迷迭香酸生物合成途徑中的迷迭香酸合成酶(Rosmarinicacidsynthase，RAS)基因(命名為PerRAS)全長(zhǎng)cDNA序列（GenBank登錄號(hào):KC355369），并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和表達(dá)譜研究。
　　通過對(duì)已報(bào)道的唇

2、形科植物丹參（Salviamiltiorrhiza）、彩葉草（Solenoatemonscutellarioides）、香蜂草（Melissaofficinalis）等的RAS基因比對(duì)，分析保守序列并設(shè)計(jì)引物，采用RACE技術(shù)克隆到1516bp的cDNA全長(zhǎng)，包含1299bp的開放閱讀框(ORF)，編碼432個(gè)氨基酸，72bp的5'非編碼區(qū)(5'UTR)和145bp的3'非編碼區(qū)(3'UTR)。BLAST比對(duì)顯示該基因與已報(bào)道的RAS基

3、因具有很高的相似性，其ORF序列與香蜂草、丹參和彩葉草的相似度分別為89.76％、87.67％和87.45％，與薰衣草（Lavandulaangustifolia）的ORF序列相似度為79.73％;氨基酸序列與丹參、彩葉草、香蜂草和薰衣草的總相似度為84.13％。
　　用生物信息學(xué)軟件對(duì)所克隆到的紫蘇PerRAS基因進(jìn)行序列分析。結(jié)果表明，其編碼的氨基酸親水性分析表現(xiàn)為疏水性;信號(hào)肽研究結(jié)果表明其不存在信號(hào)肽酶切位點(diǎn)，不具有信號(hào)肽

4、。同時(shí)，跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示其不具有跨膜結(jié)構(gòu)域。對(duì)紫蘇RAS蛋白前體的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，其含有19.68％的α螺旋、24.30％的延伸鏈和56.02％的隨機(jī)卷曲;進(jìn)一步對(duì)其高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，得到了紫蘇RAS蛋白的三維模型。RAS系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，各RAS基因編碼的蛋白均有明顯的種屬特性，紫蘇RAS與唇形科植物RAS親緣關(guān)系最近，且RAS基因早在被子植物和裸子植物中就已經(jīng)存在，是一個(gè)古老的基因。
　　以紫蘇β-Actin基因

5、作內(nèi)標(biāo)，采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)PerRAS基因的表達(dá)譜進(jìn)行分析，結(jié)果表明PerRAS基因在根中的表達(dá)豐度最高，莖中最低，推斷紫蘇迷迭香酸（Rosemaryacid，RA）的合成途徑中RAS在根中起主要的催化作用;30min的UV-B照射、200μmol/LH2O2分別在一定程度上下調(diào)PerRAS基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，推測(cè)PerRAS可能參與紫蘇對(duì)氧化脅迫的應(yīng)激反應(yīng);500μmol/LMeJA一定程度的上調(diào)PerRAS基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。