大腸桿菌蘋果酸脫氫酶基因mdh克隆、高效表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、蘋果酸脫氫酶(MDH)是三羧酸循環(huán)中的一個(gè)關(guān)鍵酶,在生物體內(nèi)普遍存在,MDH以NADH或NAD+為輔因子,催化蘋果酸鹽與草酰乙酸鹽的相互轉(zhuǎn)化。
　　 本課題以大腸桿菌基因組為模板,分子克隆了939 bp的mdh基因,并與表達(dá)載體pET-28a(+)連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,得到重組菌pET-28a-mdh/BL21。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組菌,利用表達(dá)載體pET-28a(+)上的6His·Tag標(biāo)記選用Ni2+柱純化具有酶活性的M

2、DH,表達(dá)后的粗酶液比酶活是43 U/mg,純化后的比酶活是112.5 U/mg,純化倍數(shù)達(dá)2.62倍,回收率為59％。并對(duì)該酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究,其中反應(yīng)最適pH值為6.0,在pH值2.0-6.0的酸性范圍內(nèi)穩(wěn)定,反應(yīng)最適溫度為37℃,在42℃以下酶的穩(wěn)定性較好。K+對(duì)酶有明顯的激活作用,Ni2+、Co2+、Fe3+對(duì)酶稍有激活作用。Cu2+、Zn2+對(duì)酶有明顯的抑制作用。Hg2+對(duì)酶有很強(qiáng)的抑制作用。醇類對(duì)酶的活力影響不大,丙

3、三醇可顯著提高酶的熱穩(wěn)定性。酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)以草酰乙酸為底物的Km為0.235 mmol/L,Vmax為0.47μmol/L.min。
　　 本實(shí)驗(yàn)還將蘋果酸脫氫酶基因連接到分泌表達(dá)載體pET-22b(+)上,再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),實(shí)現(xiàn)了蘋果酸脫氫酶的胞外表達(dá),采用細(xì)胞裂解緩沖液一步提取法快速地在大腸桿菌的周質(zhì)中獲得了目的蛋白,并測得該蛋白比酶活為48.2 U/mg。
　　 為了提高M(jìn)DH的熱穩(wěn)定性,本

4、實(shí)驗(yàn)以重組質(zhì)粒pET-28a-mdh為模板,采用基因定點(diǎn)突變技術(shù)在蘋果酸脫氫酶基因中引入三個(gè)點(diǎn)突變(1225K、D45E、Q229E)。將突變基因與表達(dá)載體pET-28a(+)連接,轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組菌,利用表達(dá)載體pET-28a(+)上的His6·Tag標(biāo)記選用Ni2+柱純化蘋果酸脫氫酶,在不同的溫度(35℃、45℃、55℃、65℃)下保溫一小時(shí),測定不同溫度下的比酶活,以未經(jīng)點(diǎn)突變的蘋果酸脫氫酶為

5、對(duì)照,發(fā)現(xiàn)在Q229E處對(duì)蘋果酸脫氫酶基因進(jìn)行定點(diǎn)突變后的MDH熱穩(wěn)定性較好。45℃保溫一小時(shí)后的相對(duì)酶活仍有73％,65℃相對(duì)酶活為44％。而在L225K和D45E處定點(diǎn)突變后表達(dá)的MDH,在45℃相對(duì)酶活分別為56.5％和38.6％,到65℃時(shí)的酶活損失較大,分別為28.6％和9％;未經(jīng)定點(diǎn)突變的MDH在45℃相對(duì)酶活為45.6％,65℃的相對(duì)酶活為3.7％。說明在L225K和D45E處對(duì)MDH的定點(diǎn)改造沒有明顯提高蘋果酸脫氫酶的熱