（R）-羥基苯乙酮還原酶與甲酸脫氫酶基因在大腸桿菌中的共表達(dá).pdf

1、生物催化的不對(duì)稱還原反應(yīng)中，輔酶不能循環(huán)使用是限制其工業(yè)化應(yīng)用的“瓶頸”因素。全細(xì)胞可以通過(guò)自身代謝為反應(yīng)提供一定量的輔酶，但按照化學(xué)當(dāng)量平衡，當(dāng)?shù)孜餄舛忍岣撸磻?yīng)所需的輔酶量增加時(shí)，輔酶的供給就成為主要的限制因素。本文根據(jù)大腸桿菌對(duì)密碼子的偏好性，對(duì)近平滑假絲酵母(CandidaparapsilosisCCTCCM203011)的(R)-羥基苯乙酮還原酶基因rcr進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。用PCR的方法從博伊丁假絲酵母(Candidaboid

2、inii)基因組中擴(kuò)增出甲酸脫氫酶基因fdh，將兩個(gè)基因克隆構(gòu)建到共表達(dá)載體pETDuetTM-1后，轉(zhuǎn)化稀有密碼子優(yōu)化型菌株EcoliRosetta，實(shí)現(xiàn)了(R)-羥基苯乙酮還原酶和甲酸脫氫酶基因的高效共表達(dá)。以高濃度(5g/L)的2-羥基苯乙酮和適量的甲酸鈉為底物，0.1g重組菌細(xì)胞催化產(chǎn)生(R)-苯基乙二醇，進(jìn)行了不對(duì)稱還原反應(yīng)條件的選擇，為基因工程法生物合成(R)-苯基乙二醇的工業(yè)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果包括： (1

3、)以實(shí)驗(yàn)室保藏的C.parapsilosis基因組為模板，根據(jù)(R)-羥基苯乙酮還原酶基因序列和大腸桿菌密碼子的偏好性，設(shè)計(jì)引物Rcr-F1和Rcr-R1，Rcr-F2和Rcr-R2，以及Rcr-F3和Rcr-R2，用PCR的方法擴(kuò)增出目的基因rcr的前半段(約800bp)和后半段(約200bp)，然后用重疊延伸PCR(splicingoverlappingextension-PCR，SOE-PCR)的方法連接兩段基因獲得密碼子優(yōu)化后的

4、全長(zhǎng)基因rcr。將rcr克隆到pMD19-T載體中，獲得重組質(zhì)粒T-rcr，測(cè)序結(jié)果表明rcr序列全長(zhǎng)為1011bp，編碼336個(gè)氨基酸。 (2)以實(shí)驗(yàn)室保藏的C.boidinii基因組為模板，根據(jù)已報(bào)道的C.boidinii的fdh基因序列(AccessionNo.AJ011046)，利用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)引物Fdh-F和Fdh-R，PCR法擴(kuò)增出基因fdj后連接到pMD19-T載體中，獲得重組質(zhì)粒T-fdh，測(cè)序結(jié)果表明r

5、cr基因全長(zhǎng)為1095bp，編碼364個(gè)氨基酸。 (3)將rcr與fdh基因同時(shí)構(gòu)建到共表達(dá)質(zhì)粒pETDuetTM-1中，獲得重組質(zhì)粒pETDuet-rcr-fdh。將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化密碼子優(yōu)化型菌株E.coliRosseta，獲得(R)-羥基苯乙酮還原酶和甲酸脫氫酶基因的共表達(dá)陽(yáng)性克隆。經(jīng)30℃，1mmol/LIPTG誘導(dǎo)8h，SDS-PAGE結(jié)果表明(R)-羥基苯乙酮還原酶和甲酸脫氫酶均有明顯表達(dá)，其相對(duì)分子質(zhì)量分別為37k

6、Da和40kDa。通過(guò)搖瓶條件的研究,確定了重組蛋白的最佳誘導(dǎo)條件為：250mL的三角瓶中裝液量20％，培養(yǎng)液的OD600值為0.8開始誘導(dǎo)，誘導(dǎo)溫度為30℃，IPTG的濃度為0.8mmol/L，誘導(dǎo)16h結(jié)束培養(yǎng)。由于引物設(shè)計(jì)時(shí)插入了6×His標(biāo)簽，因而通過(guò)Ni2+離子柱親和層析一步純化，同時(shí)獲得了較純的兩種酶蛋白。 (4)對(duì)重組菌全細(xì)胞催化2-羥基苯乙酮不對(duì)稱還原反應(yīng)的條件進(jìn)行了選擇，結(jié)果表明當(dāng)?shù)孜?-羥基苯乙酮濃度為5g/