（R）-羥基苯乙酮還原酶與甲酸脫氫酶基因在大腸桿菌中的共表達.pdf

1、生物催化的不對稱還原反應中，輔酶不能循環(huán)使用是限制其工業(yè)化應用的“瓶頸”因素。全細胞可以通過自身代謝為反應提供一定量的輔酶，但按照化學當量平衡，當?shù)孜餄舛忍岣撸磻璧妮o酶量增加時，輔酶的供給就成為主要的限制因素。本文根據(jù)大腸桿菌對密碼子的偏好性，對近平滑假絲酵母(CandidaparapsilosisCCTCCM203011)的(R)-羥基苯乙酮還原酶基因rcr進行了密碼子優(yōu)化。用PCR的方法從博伊丁假絲酵母(Candidaboid

2、inii)基因組中擴增出甲酸脫氫酶基因fdh，將兩個基因克隆構建到共表達載體pETDuetTM-1后，轉化稀有密碼子優(yōu)化型菌株EcoliRosetta，實現(xiàn)了(R)-羥基苯乙酮還原酶和甲酸脫氫酶基因的高效共表達。以高濃度(5g/L)的2-羥基苯乙酮和適量的甲酸鈉為底物，0.1g重組菌細胞催化產(chǎn)生(R)-苯基乙二醇，進行了不對稱還原反應條件的選擇，為基因工程法生物合成(R)-苯基乙二醇的工業(yè)應用奠定了基礎。主要研究結果包括： (1

3、)以實驗室保藏的C.parapsilosis基因組為模板，根據(jù)(R)-羥基苯乙酮還原酶基因序列和大腸桿菌密碼子的偏好性，設計引物Rcr-F1和Rcr-R1，Rcr-F2和Rcr-R2，以及Rcr-F3和Rcr-R2，用PCR的方法擴增出目的基因rcr的前半段(約800bp)和后半段(約200bp)，然后用重疊延伸PCR(splicingoverlappingextension-PCR，SOE-PCR)的方法連接兩段基因獲得密碼子優(yōu)化后的

4、全長基因rcr。將rcr克隆到pMD19-T載體中，獲得重組質粒T-rcr，測序結果表明rcr序列全長為1011bp，編碼336個氨基酸。 (2)以實驗室保藏的C.boidinii基因組為模板，根據(jù)已報道的C.boidinii的fdh基因序列(AccessionNo.AJ011046)，利用DNAMAN軟件設計引物Fdh-F和Fdh-R，PCR法擴增出基因fdj后連接到pMD19-T載體中，獲得重組質粒T-fdh，測序結果表明r

5、cr基因全長為1095bp，編碼364個氨基酸。 (3)將rcr與fdh基因同時構建到共表達質粒pETDuetTM-1中，獲得重組質粒pETDuet-rcr-fdh。將重組表達質粒轉化密碼子優(yōu)化型菌株E.coliRosseta，獲得(R)-羥基苯乙酮還原酶和甲酸脫氫酶基因的共表達陽性克隆。經(jīng)30℃，1mmol/LIPTG誘導8h，SDS-PAGE結果表明(R)-羥基苯乙酮還原酶和甲酸脫氫酶均有明顯表達，其相對分子質量分別為37k

6、Da和40kDa。通過搖瓶條件的研究,確定了重組蛋白的最佳誘導條件為：250mL的三角瓶中裝液量20％，培養(yǎng)液的OD600值為0.8開始誘導，誘導溫度為30℃，IPTG的濃度為0.8mmol/L，誘導16h結束培養(yǎng)。由于引物設計時插入了6×His標簽，因而通過Ni2+離子柱親和層析一步純化，同時獲得了較純的兩種酶蛋白。 (4)對重組菌全細胞催化2-羥基苯乙酮不對稱還原反應的條件進行了選擇，結果表明當?shù)孜?-羥基苯乙酮濃度為5g/