剛地弓形蟲棒狀體ROP18基因的克隆、表達及ROP18蛋白抗感染免疫保護力的研究.pdf

1、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是重要的機會性致病原蟲，廣泛寄生于人體及動物的組織細胞內(nèi)，引起人獸共患病。據(jù)美國華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院的流行病學(xué)家調(diào)查研究估計，人類每四個人中就有一人感染弓形蟲，但通常只有免疫功能低的人才會因為感染弓形蟲而表現(xiàn)出臨床癥狀。免疫系統(tǒng)正常的人也有可能因此患上嚴重的眼部疾病或中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，女性可造成所懷胎兒的先天性缺陷或死亡。
　　隨著分子生物學(xué)技術(shù)在寄生蟲學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展，弓形蟲疫苗

2、從最早的全蟲疫苗到新近迅速發(fā)展起來的核酸疫苗均取得了很大進展。但是弓形蟲滅活疫苗免疫保護力低，減毒活疫苗有恢復(fù)毒力的風險，不能用于人體，而基因工程多肽疫苗的制備費用高、抗原性弱、制備過程復(fù)雜，因此，研制一款安全、有效的抗弓形蟲疫苗對于保護易感人群以及促進人類優(yōu)生優(yōu)育具有重要意義。
　　弓形蟲的頂端復(fù)合體在蟲體侵入宿主細胞過程中起著重要的作用，其中對棒狀體的研究較為廣泛、深入。作為棒狀體蛋白家族成員之一的ROP18被認為是目前發(fā)現(xiàn)的

3、最有可能與弓形蟲入侵人體并在宿主細胞內(nèi)存活、大量繁殖有關(guān)的影響因子。因此，本文以剛地弓形蟲RH株棒狀體蛋白ROP18為研究對象，探討其是否具有抗原性及免疫保護作用。
　　首先提取剛地弓形蟲RH株基因組DNA，通過PCR擴增棒狀體蛋白18（TgROP18）基因。擴增產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后連接到原核表達載體pET30a(+)，建立重組表達載體pET30a(+)-TgROP18，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌E.coli BL21(DE3)，陽性菌落

4、加入異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達。用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAG)分析重組蛋白TgROP18的表達情況，同時以鼠抗弓形蟲血清為一抗，蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)分析該重組蛋白的免疫反應(yīng)性。實驗結(jié)果顯示，PCR擴增獲得TgROP18基因，長約1665 bp，編碼554個氨基酸，其中前47個氨基酸構(gòu)成信號肽序列。菌落PCR、雙酶切和測序結(jié)果進一步驗證重組質(zhì)粒ET30a(+)-TgRO

5、P18構(gòu)建成功。SDS-PAGE實驗證實，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)可獲得相對分子質(zhì)量（Mr）為59800的可溶性重組蛋白TgROP18。最終經(jīng)Western blotting分析，該重組蛋白可被鼠抗剛地弓形蟲的血清識別。
　　確定融合蛋白His-ROP18成功表達后，誘導(dǎo)小鼠抗攻擊感染實驗。將60只5～6周齡的雌性Balb/c小鼠，體重(18～20)g左右，隨機分成4組，每組15只。分別接種His-TgROP18-FCA(A組)、His-T

6、gROP18(B組）、弗氏完全佐劑(freund's complete adjuvant，F(xiàn)CA)（C組）和PBS(D組)。經(jīng)腹腔注射，免疫劑量50μg/只，時間順序為0d-20d-34d。每次免疫前尾部靜脈采血，收集血清進行細胞因子水平測定。最后一次免疫后1周，對所有小鼠經(jīng)腹腔注射感染含弓形蟲速殖子103-5個/只，通過觀察小鼠生存率及免疫前后細胞因子白介素17(interleukin-17，IL-17)、γ干擾素(interfero

7、n-γ，IFN-γ)、白介素10(interleukin-10，IL-10)和白介素4(interleukin-4，IL-4)水平的變化分析弓形蟲RH株ROP18蛋白的作用及機制。結(jié)果A組小鼠IL-4濃度均值54.17 ng·L-1，IL-10濃度均值106.88 ng·L-1，IL-17濃度均值5.02 ng·L-1，INF-γ濃度均值166.96ng·L-1;B組小鼠IL-4濃度均值52.56 ng·L-1，IL-10濃度均值103

8、.34ng·L-1，IL-17濃度均值4.99 ng·L-1，INF-γ濃度均值142.42 ng·L-1;C組小鼠IL-4濃度均值73.06 ng·L-1，IL-10濃度均值144.40 ng·L-1，IL-17濃度均值13.34 ng·L-1、，INF-γ濃度均值73.64 ng·L-1;D組小鼠IL-4濃度均值68.29 ng·L-1，IL-10濃度均值145.29 ng·L-1，IL-17濃度均值14.97ng·L-1，INF-

9、γ濃度均值76.50 ng·L-1。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)軟件單因素分析可知免疫后小鼠與對照組(B、C)相比，實驗組(A、B)小鼠細胞因子IFN-γ水平明顯升高(P＜0.05)，而IL-10、IL-4、IL-17水平有所降低(P＜0.05)，這些表現(xiàn)均符合各項細胞因子的生物學(xué)特點。后經(jīng)抗感染免疫攻擊實驗，實驗組小鼠與對照組小鼠中位生存期時間6～7 d相比，其中位生存時間延長至22～25 d。以上實驗結(jié)果證實了:1.本實驗室成功克隆TgROP18基因，