細(xì)胞紅蛋白的基因表達(dá)、分離純化與性能研究.pdf

1、細(xì)胞紅蛋白(Cytoglobin, Cygb)是近期在脊椎動(dòng)物組織中發(fā)現(xiàn)的第四種珠蛋白,它雖具有典型珠蛋白“three-over-three”類型的?-螺旋三明治折疊結(jié)構(gòu),但其蛋白肽鏈E-螺旋中的His81卻與血紅素配位,形成與神經(jīng)紅蛋白(Neuroglobin, Ngb)相似的六配位結(jié)構(gòu)。在Cygb的血紅素附近有一個(gè)與外部相連的大的疏水性蛋白基質(zhì)空腔,可能用于提供配體進(jìn)出的路徑。Cygb幾乎在人體各類組織中都有表達(dá),可能具有攜氧、儲(chǔ)氧

2、、氧感受器以及過氧化物酶等功能,此外它也可能與膠原形成有關(guān),但其具體的生物功能仍未完全明確。因此本文對細(xì)胞紅蛋白進(jìn)行了基因表達(dá)和分離純化,并研究了其基本的化學(xué)生物學(xué)性質(zhì)以及可能的生物功能。主要的工作有:
　　一、細(xì)胞紅蛋白的基因表達(dá)、分離純化與譜學(xué)表征。將帶有人細(xì)胞紅蛋白基因pET3a質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E. Coli BL21(DE3)plys中進(jìn)行發(fā)酵表達(dá),細(xì)胞紅蛋白以可溶性和包涵體兩種形式同時(shí)表達(dá)?？扇苄缘鞍滓来谓?jīng)硫酸銨分級沉淀,Hi

3、prep16/10 Q FF陰離子交換柱,Hiload16/60 Superdex75凝膠過濾柱和 CM Sepharose FF陽離子交換柱純化,得到電泳純的可溶性蛋白(Scygb);包涵體蛋白經(jīng)鹽酸胍變性溶解、外加血紅素重組和柱層析得到了電泳純的可溶性蛋白(Icygb)。
　　電噴霧質(zhì)譜測得Scygb的分子量為21403.8 Da,Icygb的分子量則為21556.8 Da。紫外可見光譜表明,Scygb和Icygb的氧化態(tài)都在

4、416 nm處有強(qiáng)的吸收峰,500 nm~600 nm間有寬的弱吸收峰,還原態(tài)都在428 nm,531 nm和561nm有吸收峰,但兩者的A428(R)與A416(O)峰值比有所差別。熒光光譜表明,Scygb和Icygb的發(fā)射光譜的最大波長都為340 nm。但相同濃度時(shí),Scygb的熒光強(qiáng)度要比Icygb的熒光強(qiáng)度高一倍左右。圓二色光譜表明,Scygb和Icygb的α-螺旋相對含量分別為64.4％和62.0%。還原態(tài)均在424 nm和5

5、55 nm處有正峰,氧化態(tài)都在257 nm和412 nm處有正峰,在285 nm處有負(fù)峰。但與Icygb相比,Scygb的還原態(tài)在425 nm處呈現(xiàn)一負(fù)峰,氧化態(tài)在453 nm處呈現(xiàn)一負(fù)峰。兩者的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性的變化情況也不相同。通過以上對比,得出由可溶性形式純化出的Cygb應(yīng)該更接近于天然態(tài),因此主要對這種形式的蛋白進(jìn)行了深入研究。
　　二、細(xì)胞紅蛋白的熒光光譜和圓二色光譜研究。利用同步熒光光譜、熒光探針和熒光猝滅研究了C

6、ygb的熒光特性以及溶液pH和巰基乙醇(2-ME)對Cygb構(gòu)象的影響。波長差為20 nm和80 nm時(shí)Cygb在不同濃度下的同步熒光光譜結(jié)果表明,蛋白濃度對肽鏈中色氨酸和酪氨酸的熒光強(qiáng)度的影響不相同。波長差為20 nm和80 nm時(shí)Cygb在不同 pH值溶液中的同步熒光光譜結(jié)果表明,在酸性環(huán)境中色氨酸和酪氨酸熒光峰的強(qiáng)度迅速增大,在堿性環(huán)境中兩者熒光峰的強(qiáng)度明顯降低。ANS熒光探針表明,在酸性環(huán)境中蛋白分子的構(gòu)象發(fā)生了改變,出現(xiàn)能夠結(jié)

7、合ANS的疏水區(qū)。利用丙烯酰胺和I-、Cs+離子在有或無2-ME存在下對Cygb內(nèi)源熒光進(jìn)行猝滅作用的研究表明,三種猝滅劑對Cygb的熒光猝滅遵循Stern-Volmer方程,但它們的猝滅效率明顯不同。當(dāng)向蛋白溶液中加入2-ME后,三種猝滅劑對Cygb熒光基團(tuán)的猝滅常數(shù)均有所增加。
　　利用圓二色光譜研究了環(huán)境因素對Cygb二級結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明,在蛋白濃度較低時(shí),蛋白含有較高的?-螺旋。隨著溫度的升高,Cygb的?-螺旋含量逐

8、漸減小。即使溫度達(dá)到95℃,它仍保持有20%的α-螺旋結(jié)構(gòu),說明 Cygb具有較高的熱穩(wěn)定性。在弱酸性和弱堿性溶液中,Cygb的二級結(jié)構(gòu)都會(huì)有不同程度的破壞。在甲醇和乙醇中,Cygb的α-螺旋含量明顯增加,這說明醇類可以誘導(dǎo)其α-螺旋的生成。
　　三、細(xì)胞紅蛋白的去折疊研究。利用紫外可見光譜、熒光光譜和圓二色光譜研究了酸誘導(dǎo)細(xì)胞紅蛋白的去折疊過程。結(jié)果表明,隨著酸度的增加,Cygb分子中血紅素逐漸脫離蛋白鏈;蛋白的熒光強(qiáng)度顯著增加

9、;二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋含量逐漸降低。但酸誘導(dǎo)細(xì)胞紅蛋白的去折疊并不徹底。
　　利用紫外可見光譜、熒光光譜、熒光相圖法和圓二色光譜研究了在有或無2-ME存在時(shí),尿素和鹽酸胍誘導(dǎo)細(xì)胞紅蛋白的去折疊過程。結(jié)果表明:Cygb具有較強(qiáng)的抗尿素變性作用,即使尿素濃度達(dá)到10.0 mol/L時(shí),變性也不完全;二硫鍵的破壞,降低了蛋白分子的穩(wěn)定性。Cygb在尿素中的變性為“三態(tài)模型”,N-Iurea?U。在2-ME存在的尿素溶液中,其變性過程變?yōu)閺?fù)

10、雜的“四態(tài)模型”。Cygb在鹽酸胍中的變性較為徹底,其血紅素明顯脫落。無2-ME存在時(shí),當(dāng)鹽酸胍濃度達(dá)到4.5 mol/L時(shí),蛋白變性完全,其變性中點(diǎn)Tm為3.5 mol/L。Cygb在鹽酸胍中的去折疊過程為的“三態(tài)模型”,N→U→R。2-ME存在下蛋白從0.5 mol/L鹽酸胍即開始變性,變性中點(diǎn)Tm降為2.0 mol/L,仍為“三態(tài)模型”。
　　利用紫外可見光譜、熒光光譜和圓二色光譜研究了細(xì)胞紅蛋白在甲醇和乙醇溶液中的去折疊和

11、再折疊過程。去折疊過程的研究結(jié)果表明,隨著醇濃度的增加,紫外可見吸收光譜中Soret帶的最大吸收峰發(fā)生藍(lán)移;熒光發(fā)射光譜的最大峰位發(fā)生紅移;二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋含量明顯升高。通過比較,乙醇的變性能力大于甲醇。再折疊過程的研究結(jié)果表明,再折疊過程與去折疊過程是可逆的,說明Cygb中肽鏈與血紅素重組的路徑和解離過程基本相同。
　　四、細(xì)胞紅蛋白的性能研究。利用紫外可見吸收光譜和動(dòng)力學(xué)過程研究了細(xì)胞紅蛋白的過氧化物酶催化活性。研究結(jié)果表明

12、,Cygb具有一定的類過氧化物酶的酶活性。Cygb催化H2O2氧化鄰甲氧基苯酚的最大反應(yīng)速率Vm為54.9μmolL-1min-1,米氏常數(shù)Km為5.11×10-3 molL-1,轉(zhuǎn)化數(shù)為Kcat=11.0 min-1。在堿性環(huán)境和較高溫度下,酶促反應(yīng)的初速度明顯增大。
　　利用紫外可見吸收光譜研究了細(xì)胞紅蛋白與硫化氫的相互作用。隨著 H2S濃度的增大,細(xì)胞紅蛋白416 nm處的吸收峰逐漸降低并紅移至428 nm,之后再逐漸增大,

13、在531 nm、560 nm和606 nm處形成較明顯的吸收峰,這說明H2S可以還原氧化態(tài)的Cygb。當(dāng)溫度高于45℃時(shí),Cygb與H2S的反應(yīng)速率明顯增大。在pH6.0時(shí)Cygb與H2S的反應(yīng)速率最大。
　　五、脫輔基細(xì)胞紅蛋白(Apocygb)與金屬卟啉的重組及脫輔基蛋白的穩(wěn)定性研究。紫外可見光譜結(jié)果表明,Apocygb與Fe(III)PPIX重組后,立即在412 nm處形成新吸收峰,后移至416 nm處,還原態(tài)在428 nm

14、處形成強(qiáng)吸收峰。Apocygb與Fe(III)PPIX的重組動(dòng)力學(xué)過程包括小于0.2 s的快反應(yīng)階段和直到5 min還未完全平衡的慢反應(yīng)階段。Apocygb與Co(III)PPIX和Mn(III)PPIX的重組具有相似的過程。
　　利用內(nèi)源性熒光、外源性熒光探針ANS的熒光光譜和圓二色光譜研究了脫輔基細(xì)胞紅蛋白在酸、尿素和鹽酸胍中的去折疊過程。結(jié)果表明,Apocygb在pH7.5~6.0范圍內(nèi)以天然態(tài)存在,在pH5.5~4.0之間