擬南芥細(xì)胞G蛋白的分離純化及不同處理對(duì)G蛋白α亞基表達(dá)的影響.pdf

1、G蛋白偶聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是一類重要的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與許多重要生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)。G蛋白于20世紀(jì)80年代首先在動(dòng)物中被發(fā)現(xiàn)，并對(duì)其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理進(jìn)行了廣泛而深入的研究。而在植物中的研究到80年代后期才開(kāi)始，處于相對(duì)滯后階段。擬南芥是一種模式植物，對(duì)擬南芥植物基因組序列的分析表明，在擬南芥中有1個(gè)編碼α亞基(GPA1)、1個(gè)編碼β亞基(AGB1)和2個(gè)編碼γ亞基(AGG1、AGG2)的基因。最近對(duì)G蛋白偶聯(lián)信號(hào)途徑的研究顯示：分析G蛋

2、白Gα、Gβ和Gγ三個(gè)亞基間的相互作用對(duì)闡明其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理至關(guān)重要，而研究亞基間的相互作用必須首先分離純化相應(yīng)的蛋白質(zhì)。 本文以擬南芥哥倫比亞(col)野生型懸浮培養(yǎng)細(xì)胞為材料，通過(guò)超聲波破碎、硫酸銨沉淀、凝膠過(guò)濾、離子交換等純化手段，結(jié)合SDS-PAGE、Native-PAGE、Westernblotting等方法，從擬南芥細(xì)胞中分離純化了G蛋白，并對(duì)分離純化條件作了一些優(yōu)化，為以后的深入研究提供了一些理論依據(jù)。同時(shí)通過(guò)對(duì)植

3、株和細(xì)胞的不同處理(包括土壤干旱、PEG-8000和NaCl模擬干旱、ABA等激素、CTX以及溫度等)，研究了擬南芥G蛋白Gα的表達(dá)情況，證實(shí)了G蛋白參與了多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。具體研究結(jié)果為： 1.優(yōu)化了G蛋白的分離純化條件：從細(xì)胞的超聲波破碎，研磨，離心，40-60％飽和度的硫酸銨分步沉淀，SephadexG-25脫鹽、DEAE-SepharoseFastFlow離子交換、SephadexG-200凝膠過(guò)濾，最后經(jīng)過(guò)DEAE-

4、SepharoseCL-6B得到純化的目的蛋白，蛋白質(zhì)收率為0.1052％。 2.純化的蛋白質(zhì)Native-PAGE顯示為一條帶，經(jīng)過(guò)Westernblotting確定能與Gα亞基的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，證實(shí)為G蛋白。 3.Native-PAGE分離膠濃度對(duì)G蛋白電泳的影響：經(jīng)過(guò)T=3％的濃縮膠后，G蛋白不能進(jìn)入T為12％的分離膠，而在T為7％、8％和10％的分離膠上的遷移率也很小，在T=6％的分離膠上分離效果較好。其主

5、要原因可能是三聚體G蛋白分子量較大的導(dǎo)致的。 4.純化的蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)Native-PAGE分離后的，回收其目的蛋白，再進(jìn)行SDS-PAGE，發(fā)現(xiàn)有3條帶。一條是Gα亞基，其分子量為60kDa左右；另外2條帶分子量為45kDa和35kDa，可能是β、γ亞基，證實(shí)擬南芥中存在異三聚體G蛋白。 5.通過(guò)對(duì)擬南芥的不同處理，發(fā)現(xiàn)土壤干旱，PEG-8000和NaCl模擬干旱，抑制了G蛋白α亞基的表達(dá)。ABA處理同樣抑制α亞基的表