藻藍(lán)蛋白亞基光動(dòng)力治療對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白影響的研究.pdf

1、目的:自天然螺旋藻粉中純化出高純度藻藍(lán)蛋白亞基;確定藻藍(lán)蛋白亞基PDT致腫瘤細(xì)胞死亡的最佳劑量;制備鑒定純化PRAS40-S183磷酸化多克隆抗體;探究PC亞基PDT介導(dǎo)細(xì)胞凋亡對(duì)凋亡相關(guān)蛋白PRAS40、LKB1表達(dá)量及磷酸化水平的影響。
　　方法:鹽溶、鹽析、離心、SEPHADEX G-75柱層析分離純化藻藍(lán)蛋白,紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)全波長(zhǎng)掃描檢測(cè)純度,SDS-PAGE紫外檢測(cè)亞基狀態(tài),透析除鹽、凍干備用;正常培養(yǎng)人胚胎腎細(xì)胞

2、HEK293、人肺癌細(xì)胞A549,以系列濃度PC亞基(0,25,50,75,100,125,150,200μg/mL)、30J/cm2光照處理上述細(xì)胞8min,MTT法檢測(cè)細(xì)胞死亡情況,確定致非腫瘤細(xì)胞最大限度生存、腫瘤細(xì)胞最大限度死亡的最佳PDT劑量范圍,在此范圍內(nèi)吖啶橙染色熒光顯微鏡觀察計(jì)數(shù)確定致最大細(xì)胞凋亡率的最佳PDT劑量;通過(guò)蛋白疏水性抗原性分析設(shè)計(jì)多肽抗原,用其免疫家兔獲得抗血清,ELISA檢測(cè)其效價(jià),用rProtein A

3、 Sepharose親和層析純化并經(jīng)非磷酸化的抗原條吸附處理后的抗體,Western Blot法檢測(cè)正常細(xì)胞HL7702、HEK293及腫瘤細(xì)胞HepG2、A549、S180,經(jīng)饑餓處理HEK293細(xì)胞觀察S183磷酸化水平變化;Western blot檢測(cè)PC亞基PDT對(duì)A549細(xì)胞LKB1、PRAS40量變及磷酸化水平的影響。
　　結(jié)果:紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)表明純化出高純度藻藍(lán)蛋白,SDS-PAGE紫外顯示為亞基混合物;MT

4、T法得知低劑量PDT(PC亞基濃度25μg/mL)可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng);高劑量的PDT可以導(dǎo)致細(xì)胞死亡;在光照功率恒定的情況下,A549人肺癌細(xì)胞的半數(shù)致死PC亞基濃度約為60μg/mL,HEK293非腫瘤細(xì)胞的半數(shù)致死PC亞基濃度約為120μg/mL;最佳PDT劑量范圍是光照30J/cm2,8min，PC亞基濃度75μg/mL和100μg/mL,以吖啶橙染色熒光顯微鏡觀察計(jì)數(shù)計(jì)算得知,致高凋亡率最佳PDT劑量是光照30J/cm2,8min

5、,PC亞基濃度100μg/mL;通過(guò)蛋白疏水性抗原性分析設(shè)計(jì)多肽抗原TQQYAKpS183LPV,用其免疫家兔獲得抗血清,ELISA檢測(cè)其效價(jià)為1:10000;用rProtein A Sepharose親和層析純化并經(jīng)非磷酸化的抗原條吸附處理后的抗體,Western Blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),該處理可以明顯提高磷酸化抗體的特異性;對(duì)正常細(xì)胞HL7702、HEK293及腫瘤細(xì)胞HepG2、A549、S180的檢測(cè)顯示,磷酸化的Ser183在不同

6、細(xì)胞中表達(dá)的差異不顯著;而經(jīng)細(xì)胞饑餓處理的HEK293細(xì)胞中卻明顯觀察到了S183磷酸化水平隨氨基酸含量的降低而減弱的現(xiàn)象;由Western blot知,隨著細(xì)胞凋亡率改變,pT336-LKB1即失活LKB1的量未見(jiàn)明顯變化,但是LKB1蛋白總量卻與其成負(fù)相關(guān),說(shuō)明有正常功能的LKB1蛋白隨著細(xì)胞凋亡的發(fā)生而量增,此與LKB1的性質(zhì)相符合,伴隨低劑量PDT作用導(dǎo)致的細(xì)胞增殖,正常LKB1的量也相應(yīng)的減少,PRAS40蛋白總量未隨PDT劑

7、量增加而產(chǎn)生明顯變化,伴隨高劑量PDT導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,S183位點(diǎn)的磷酸化出現(xiàn)減少,然而,在低劑量致細(xì)胞增殖的PC亞基PDT作用下,S183位點(diǎn)的磷酸化水平未出現(xiàn)明顯變化。
　　結(jié)論:高劑量PC亞基PDT可以導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,在此細(xì)胞凋亡中LKB1、PRAS40蛋白參與了調(diào)控,抑癌蛋白LKB1通過(guò)總量不變減少失活的T336位點(diǎn)磷酸化的LKB1來(lái)達(dá)到抑制細(xì)胞增殖導(dǎo)致凋亡,PRAS40通過(guò)去磷酸化自身S183位點(diǎn)達(dá)到抑制mTORC1進(jìn)而促進(jìn)