神經(jīng)紅蛋白突變體（F28Y、V68S、Y88F、F106Y）的基因表達、分離純化和性能分析.pdf

1、神經(jīng)紅蛋白(Neuroglobin，NGB)是近期由德國科學家Burmester,T.等在人和鼠腦中發(fā)現(xiàn)的一種新穎的珠蛋白類型，主要在腦和其它神經(jīng)組織中表達。本文選擇了幾個氨基酸殘基作為突變位點，設(shè)計了F28Y,F106Y，Y88F和V68S四個突變體蛋白，目的是想引入能夠改變血紅素周圍疏水腔的極性和疏水環(huán)境的殘基，因為它們可能對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和折疊方式比較重要，可能與NGB發(fā)揮其生物功能密切相關(guān)。 本文采用PCR介導(dǎo)的定點突變

2、方法對重組人神經(jīng)紅蛋白的基因進行改造，得到了目標突變基因，DNA序列分析結(jié)果驗證了突變的正確性。 電噴霧質(zhì)譜測得的蛋白質(zhì)分子量與理論值吻合，從而驗證了突變蛋白的正確性。紫外可見光譜、熒光光譜和圓二色光譜研究表明，定點突變使得蛋白的熒光基團更加暴露于極性環(huán)境，并影響了其二級結(jié)構(gòu)的相對含量，這在突變體F28Y中表現(xiàn)的最為顯著。但這并沒有明顯地改變蛋白質(zhì)中血紅素鐵的配位環(huán)境，與野生型NGB一樣，在沒有外源配體存在的情況下，F(xiàn)28Y，V

3、68S，Y88F和F106Y突變體蛋白中血紅素輔基鐵離子在兩種氧化態(tài)下都是雙組氨酸六配位結(jié)構(gòu)。 神經(jīng)紅蛋白及其突變體對酸的穩(wěn)定性研究表明，它們在酸性溶液中不穩(wěn)定，血紅素可以脫離蛋白鏈；隨著酸度的增加，其熒光基團更加暴露于極性環(huán)境，導(dǎo)致熒光強度的顯著增加；酸的存在可以破壞神經(jīng)紅蛋白及其突變體的二級結(jié)構(gòu)。但所有的這些變化并不徹底，這可能是由于酸致變性的強度并不能完全抵消蛋白分子中的某些化學鍵和次級鍵的穩(wěn)定作用的緣故。神經(jīng)紅蛋白及其突

4、變體在酸中的穩(wěn)定性順序為：NGB＞V68S＞Y88F＞F28Y＞F106Y。 尿素變性研究表明，神經(jīng)紅蛋白相當穩(wěn)定，具有較強的抗尿素變性作用，即使尿素濃度達到9mol/L時，變性也不完全；無論從血紅素解離、熒光基團的環(huán)境還是從二級結(jié)構(gòu)上看，神經(jīng)紅蛋白及其突變體的穩(wěn)定性順序均為：NGB＞Y88F＞V68S＞F28Y＞F106Y。二硫鍵的破壞，降低了蛋白分子對尿素的穩(wěn)定性，二硫鍵具有穩(wěn)定蛋白分子結(jié)構(gòu)的作用。NGB在尿素中的變性和復(fù)性

5、過程具有相似的CD光譜，說明蛋白鏈的折疊和去折疊的路徑基本相同，NGB在尿素中的變性過程是可逆的。尿素變性再折疊動力學表明，NGB的復(fù)性過程很快，而各突變體蛋白則相對緩慢，這在很大程度上還是歸因于定點突變對蛋白分子穩(wěn)定性的影響上。尿素誘導(dǎo)的神經(jīng)紅蛋白及其突變體去折疊的熒光相圖表明它們在尿素中的變性符合“三態(tài)模型”，而非簡單的“兩態(tài)模型”。定點突變并沒有明顯影響NGB在尿素中的變性機理。 鹽酸胍是一種很強的變性劑，NGB及其突變體

6、在鹽酸胍中的變性較為徹底，在較高鹽酸胍濃度下，蛋白變性基本達到平衡。鹽酸胍變性動力學表明，它們可在鹽酸胍中迅速的變性，并且不容易復(fù)性。它們在鹽酸胍中的穩(wěn)定性順序為：NGB＞Y88F＞V68S＞F28Y＞F106Y。NGB的鹽酸胍變性是一個非常復(fù)雜的過程，它至少包括五種蛋白質(zhì)的不同狀態(tài)，定點突變不僅可以改變蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，還可以改變其變性中間過渡態(tài)，影響蛋白質(zhì)的去折疊過程。二硫鍵在穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)上起著重要的作用，定點突變雖然降低了蛋白分子的

7、穩(wěn)定性，但對二硫鍵的影響很小。 定點突變影響了蛋白分子的穩(wěn)定構(gòu)象，對血紅素鐵原子的配位環(huán)境產(chǎn)生了微擾，使得各突變體的熱穩(wěn)定性降低。Val68和Tyr88距離血紅素相對較遠，對其軸向配體的影響較小，因此它們的穩(wěn)定性相對野生型蛋白稍有降低，而Phe28和Phe106則距離血紅素兩軸向配體較近，對血紅素的影響較大，穩(wěn)定性下降較多。突變體F106Y最不穩(wěn)定，這是由于Phe106與血紅素間存在較強的疏水作用，Phe→Tyr的改變使Phe1

8、06與血紅素間的作用力減弱，從而導(dǎo)致血紅素在熱變性條件下更容易從蛋白分子中脫離出來。神經(jīng)紅蛋白及其突變體的熱穩(wěn)定性順序為：NGB＞Y88F＞V68S＞F28Y＞F106Y，它們?nèi)N不同存在形式的熱穩(wěn)定性順序為：無二硫鍵形式＞高鐵六配位形式＞CN-結(jié)合形式。由此可見，蛋白分子內(nèi)二硫鍵的破壞增加了遠端組氨酸殘基的親合性，在一定程度上增加了蛋白分子的穩(wěn)定性；外源配體的存在，破壞了血紅素鐵的天然六配位結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致血紅素容易解離使蛋白的熱穩(wěn)定性降低

9、。因此，NGB分子內(nèi)六配位的血紅素結(jié)構(gòu)是其具有高熱穩(wěn)定性的必要條件。 熒光光譜研究表明，神經(jīng)紅蛋白及其突變體的熒光強度均可被氯化銫、碘化鉀和丙烯酰胺所猝滅，但猝滅程度不同。氯化銫不能有效地使色氨酸的熒光淬滅，碘化鉀則可使色氨酸的熒光較強淬滅，而丙烯酰胺可使色氨酸熒光絕大部分淬滅。這說明，NGB分子中只有少部分色氨酸處于分子表面且被帶正電荷的氨基酸所包圍，而大部分色氨酸則埋藏于分子內(nèi)部的疏水區(qū)中。熒光猝滅的Stern-Volmer

10、猝滅常數(shù)研究表明，神經(jīng)紅蛋白及其突變體的熒光被氯化銫、碘化鉀和丙烯酰胺所猝滅的過程都是動態(tài)的猝滅過程，猝滅劑分子與激發(fā)態(tài)蛋白分子之間發(fā)生了相互作用。不同波長差下神經(jīng)紅蛋白及其突變體的同步熒光研究表明，當△λ=20nm時，同步熒光發(fā)射峰是由酪氨酸殘基貢獻的，當△λ=80nm時，NGB及其突變體分子內(nèi)的酪氨酸和色氨酸殘基得以同時監(jiān)測。神經(jīng)紅蛋白及其突變體在不同pH下的同步熒光光譜及與ANS結(jié)合后的熒光光譜的變化表明，在酸性條件下(pH＜4.

11、0)，蛋白分子不穩(wěn)定，血紅素輔基脫離蛋白鏈，導(dǎo)致熒光強度的顯著增加；pH在5.0～10.0范圍內(nèi)，神經(jīng)紅蛋白及其突變體能夠穩(wěn)定存在。當pH大于10.0時，神經(jīng)紅蛋白及其突變體進入其堿致變性態(tài)，但這種變性作用并不能使血紅素基團脫離蛋白鏈，血紅素對色氨酸的熒光猝滅作用仍未解除。 遠紫外圓二色光譜研究表明，神經(jīng)紅蛋白的二級結(jié)構(gòu)對其周圍環(huán)境比較敏感，環(huán)境的改變將導(dǎo)致其二級結(jié)構(gòu)的明顯變化。濃度的增加，溶劑性質(zhì)的改變，溶液的酸堿性和溫度的升

12、高均能導(dǎo)致NGB二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋含量不同程度的減少，使其穩(wěn)定性降低。從近紫外和可見區(qū)的CD譜可以看出，NGB雖然與其它類型的血紅素蛋白如血紅蛋白和肌紅蛋白具有某種程度的相似性，但它也具有自己的特點。另外，血紅素周圍芳香氨基酸的存在，使得蛋白分子的CD光譜的橢圓率值有所提高，并且這種偶合效應(yīng)的大小與芳香氨基酸和血紅素之間的距離成正比。血紅素L和N帶的相互增強作用，只發(fā)生在它們之間相偶合的情況下，而不會發(fā)生在Soret和可見吸收峰之間。