食管鱗癌mtDNA編碼區(qū)ND5 F340Y突變的檢測與分析.pdf

1、目的：在對線粒體逐漸深入的研究中，人們發(fā)現(xiàn)了線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)，它存在于線粒體內(nèi)基底膜上，是一種唯一存在于核外、具有半自主性的遺傳物質(zhì)，以往的研究顯示，mtDNA的ND1基因可能影響食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展。但是mtDNA的全編碼區(qū)基因的突變及其突變基因在功能、能量代謝方面與食管鱗癌的關(guān)系如何，國內(nèi)外以往的報(bào)道較少。本研究中我們對食管鱗癌組織、正常食管粘膜組織的mtDNA進(jìn)行了全編碼區(qū)基因的檢測，

2、找出高發(fā)突變基因及高發(fā)突變位點(diǎn)，并分析其對食管鱗癌能量代謝的影響。
　　方法：以鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院胸外科和鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科，手術(shù)治療的30名食管鱗癌患者為研究對象，術(shù)中切取病人的癌組織共30例，及其相對應(yīng)的正常食管粘膜組織2例，置于負(fù)80度冰箱凍存?zhèn)溆?，通過提取組織標(biāo)本的mtDNA，利用PCR擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物純化和直接測序等技術(shù)，運(yùn)用美國 NCBI數(shù)據(jù)庫的基因序列分析軟件，將組織 mtDNA全編碼區(qū)序列與目前公認(rèn)的修正劍

3、橋標(biāo)準(zhǔn)序列(revised Cambridge Reference Sequence，rCRS)進(jìn)行比對(BLAST)，找出mtDNA全部編碼區(qū)的高發(fā)突變位點(diǎn)及高發(fā)突變基因，利用進(jìn)化保守性預(yù)測軟件(MutationAssessor)對其功能性影響進(jìn)行分析，并利用免疫組化技術(shù)分析高頻突變對食管鱗癌能量代謝的影響。
　　結(jié)果：1.在30例食管鱗癌組織中共檢測到216個(gè)mtDNA突變，包括175個(gè)種系性突變，41個(gè)體細(xì)胞性突變。在這21

4、6個(gè)mtDNA突變中共檢測到182個(gè)蛋白編碼突變(包括63個(gè)錯(cuò)義突變)。
　　2.在檢測到的216個(gè)mtDNA突變中，有10個(gè)異質(zhì)性突變，剩余全部為同質(zhì)性突變。
　　3.利用MutationAssessor軟件，通過對體細(xì)胞性和種系性錯(cuò)義突變的功能性影響分析，我們發(fā)現(xiàn)體細(xì)胞性突變(3/12)比種系性突變(2/46)有更高的功能性影響。
　　4.在這5種高功能性錯(cuò)義突變中，位于ND5基因的異質(zhì)性F340Y突變發(fā)生率最高，

5、達(dá)26.7％(8/30)，影響指數(shù)(FI score)最高，達(dá)5.235。P-AMPK(AMP-activated protein kinase，AMPK) Thr172免疫組化結(jié)果顯示食管鱗癌中F340Y突變與能量應(yīng)激狀態(tài)相關(guān)，攜帶有F340Y突變的腫瘤樣本比那些沒有突變的腫瘤樣本有更豐富的P-AMPK免疫反應(yīng)性(P<0.05)。
　　結(jié)論：在食管鱗癌患者中發(fā)現(xiàn)有5個(gè)高影響力的體細(xì)胞性和種系性突變，其中F340Y突變具有最高的影