DDX46基因在食管鱗癌中的表達(dá)及其與食管鱗癌相關(guān)性研究.pdf

1、背景：食管鱗癌是我國惡性腫瘤相關(guān)死亡的主要原因之一，雖然有手術(shù)、化療、放療以及其他輔助治療方法，但其遠(yuǎn)期療效令人沮喪，并且部分患者首次診斷時已是局部晚期或轉(zhuǎn)移性疾病，失去了手術(shù)治療的機(jī)會。食管鱗癌靶向治療的相關(guān)研究尚處于萌芽階段，目前許多靶向藥物的相關(guān)研究多針對胃-食管連接部腺癌開展，這些研究結(jié)果對于食管鱗癌是否適合尚不清楚。近年來RNA在生命系統(tǒng)中的重要作用備受關(guān)注，而DDX蛋白家族RNA解旋酶參與了RNA代謝的全過程。鑒于DDX解旋

2、酶在細(xì)胞生命活動中的重要地位，對該家族成員的功能及其與人類腫瘤關(guān)系的進(jìn)一步研究，探索其上下游效應(yīng)分子，明確其作用機(jī)制和調(diào)控機(jī)理，將為腫瘤的早期診斷和生物靶向治療提供新的途徑。
　　目的：旨在研究DDX蛋白家族RNA解旋酶成員DDX46與食管鱗癌的關(guān)系，闡明其調(diào)控機(jī)制和作用機(jī)理，以期為揭示食管鱗癌新型生物學(xué)標(biāo)記、探索新的個體化治療策略提供實驗依據(jù)。
　　方法：應(yīng)用高內(nèi)涵篩選成像系統(tǒng)（high content screening

3、。HCS）篩選食管鱗癌患者新鮮手術(shù)標(biāo)本（食管鱗癌組織和距腫瘤邊緣5 cm以上食管正常組織）中的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)了一個先前未被關(guān)注的基因：DDX蛋白家族RNA解旋酶成員DDX46基因。免疫組化染色實驗比較食管鱗癌組織和相對應(yīng)食管正常組織中DDX46蛋白的表達(dá)情況。以人永生化食管鱗狀上皮細(xì)胞Het-1A為對照，實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction。qRT-P

4、CR）檢測目的基因mRNA在食管鱗癌細(xì)胞株中的表達(dá)量。應(yīng)用RNAi技術(shù)靶向沉默食管鱗癌細(xì)胞株DDX46基因的表達(dá)，進(jìn)行Cellomics細(xì)胞計數(shù)、MTT實驗、克隆形成、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，檢測DDX46基因靶向沉默對食管鱗癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。裸鼠成瘤實驗觀察靶向沉默DDX46基因?qū)κ彻荀[癌細(xì)胞裸鼠成瘤的影響。應(yīng)用Affymetrix人類全基因表達(dá)譜芯片檢測DDX46基因敲減前后兩組食管鱗癌細(xì)胞中全基因mRNA表達(dá)豐度，Ingenui

5、ty通路分析（Ingenuity? pathway analysi。IPA）差異表達(dá)基因，差異表達(dá)基因?qū)隝PA在線工具進(jìn)行信號通路富集分析。qRT-PCR驗證目的基因敲減后，部分候選下游通路基因mRNA表達(dá)量；Western blot檢測驗證部分候選下游通路基因蛋白表達(dá)量；Stress and Apoptosis Signaling Antibody Array Kit檢測和比較兩組樣本中信號通路關(guān)鍵分子的變化，以驗證IPA生物信息分

6、析結(jié)果的可靠性。
　　結(jié)果：DDX46基因在食管鱗癌組織和細(xì)胞株中高表達(dá)，DDX46蛋白表達(dá)主要定位于細(xì)胞核。應(yīng)用DDX46-shRNA-LV靶向沉默食管鱗癌TE-1（高分化）和Eca-109（低分化）細(xì)胞中DDX46基因，檢測DDX46基因沉默后食管鱗癌細(xì)胞生物功能學(xué)變化。HCS平臺連續(xù)檢測5天，記錄各時間點的細(xì)胞數(shù)目，繪制出細(xì)胞生長曲線，與對照組相比，靶向沉默DDX46基因后TE-1和Eca-109細(xì)胞的生長均被明顯抑制；MT

7、T檢測結(jié)果顯示。TE-1和Eca-109細(xì)胞 DDX46基因敲減組與對照組在酶標(biāo)儀對波長490 nm的光的吸收率隨時間變化而逐步降低，表明RNAi靶向沉默DDX46基因使食管鱗癌細(xì)胞活力明顯減弱，顯著抑制了細(xì)胞的增殖能力；細(xì)胞克隆形成能力檢測顯示，相對于對照組。DDX46-shRNA-LV組TE-1和Eca-109細(xì)胞克隆形成數(shù)顯著減少，食管鱗癌細(xì)胞克隆形成能力受到抑制；流式細(xì)胞儀檢測 DDX46-shRNA-LV介導(dǎo)的RNAi干預(yù)后

8、TE-1和Eca-109的細(xì)胞周期分布，結(jié)果顯示，與對照組比較，RNAi沉默DDX46基因?qū)е履康募?xì)胞處于G1期的細(xì)胞增加，而處于S期的細(xì)胞減少，表明RNAi沉默DDX46基因?qū)⑹彻荀[癌細(xì)胞停滯在細(xì)胞周期的G0/G1期；Annexin V-APC單染法流式細(xì)胞儀細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示，相對于對照組，RNAi沉默TE-1和Eca-109細(xì)胞中DDX46基因的表達(dá)后，細(xì)胞凋亡率顯著增多。以Eca-109細(xì)胞為成瘤細(xì)胞，裸鼠成瘤瘤體體積增長曲線

9、顯示 RNAi靶向沉默 DDX46基因使得裸鼠瘤體生長減緩，小動物活體成像顯示DDX46-shRNA-LV組熒光區(qū)總熒光表達(dá)量和平均熒光表達(dá)量均明顯低于Control-LV組，靶向沉默DDX46基因明顯抑制Eca-109細(xì)胞裸鼠成瘤。Affymetrix人類全基因表達(dá)譜芯片檢測顯示，實驗組DDX46-shRNA-LV相對于對照組Control-LV，上調(diào)基因362個，下調(diào)基因644個。采用IPA生物信息分析，根據(jù)差異基因在經(jīng)典通路中的富

10、集情況，進(jìn)行共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，結(jié)合實驗數(shù)據(jù)預(yù)測的信號通路圖和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)支持的激活或抑制狀態(tài)的信號通路圖顯示有5條抑制的信號通路和1條激活的信號通路，PI3K為非正常表達(dá)分子。qRT-PCR檢測和Western blot檢測結(jié)果與IPA差異基因經(jīng)典通路分析結(jié)果相符合。RNAi靶向沉默TE-1細(xì)胞中DDX46基因，Western blot檢測顯示Akt和P-Akt的表達(dá)水平顯著下調(diào)；PathScan? Antibody Array檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)A

11、kt（Ser473。Phosphorylation）和IκBα（Total。N/A）蛋白表達(dá)水平明顯下降，Caspase-3（Asp175。Cleaved）蛋白表達(dá)水平上升，PI3K/Akt/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被抑制；Western blot檢測顯示RNAi靶向沉默TE-1細(xì)胞中DDX46基因后，PI3K蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)。上述結(jié)果驗證了IPA生物信息學(xué)分析結(jié)果的可靠性。
　　結(jié)論：DDX46基因在食管鱗癌組織和細(xì)胞株中高表

12、達(dá)，RNAi靶向沉默食管鱗癌細(xì)胞中的DDX46基因可抑制細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；靶向沉默DDX46基因可明顯抑制裸鼠食管鱗癌細(xì)胞成瘤。DDX46基因沉默可能是通過抑制PI3K的活性，由此參入并下調(diào)PI3K/Akt信號通路，抑制通路下游的NF-κB信號通路和mTOR信號通路，進(jìn)而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，Integrin信號通路可能通過PI3K與PI3K/Akt信號通路“Cross Talk”