食管鱗癌組織中RhoC基因的表達(dá)及其與浸潤轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究.pdf

1、食管癌是我國最常見的惡性腫瘤之一,其死亡率居世界惡性腫瘤的第六位,而食管癌的浸潤轉(zhuǎn)移又是引起食管癌患者死亡的主要因?yàn)?因此深入研究食管癌浸潤轉(zhuǎn)移的機(jī)制并探索有效的抗轉(zhuǎn)移治療措施是目前食管癌診治中的重點(diǎn)和難點(diǎn),對(duì)食管癌的防治具有重大意義。
　　 Rho(Rashomologue)家族成員(RhoA、RhoB和RhoC)是一類與Ras同源的三磷酸鳥苷(Guanosinc triohosphte,GTP)結(jié)合蛋白,研究表明,RhoC基

2、因的高表達(dá)與腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移及血管生成密切相關(guān)。近年來,先后有文獻(xiàn)報(bào)道,RhoC高表達(dá)或活性升高與乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、非小細(xì)胞肺癌和胃癌等多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。有關(guān)RhoC在食管鱗癌中的表達(dá)及其與浸潤、轉(zhuǎn)移的關(guān)系,迄今國內(nèi)外尚無系統(tǒng)性研究報(bào)道。
　　 為深入探討RhoC基因與食管鱗癌發(fā)生和浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)系,尋找抑制食管鱗癌發(fā)生和浸潤轉(zhuǎn)移的有效方法,本研究首先采用RT-PCR、原位雜交及免疫組化SP法聯(lián)合檢

3、測了食管鱗癌、癌旁不典型增生及正常食管粘膜組織中RhoC mRNA和蛋白的表達(dá)水平；采用免疫組化SP法檢測了食管鱗癌、癌旁不典型增生及正常食管粘膜組織中血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達(dá)情況,同時(shí)用CD105抗體檢測食管鱗癌組織中微血管密度(Mi-crovascularDensity,MVD),探討了RhoC表達(dá)與VEGF、MVD的相關(guān)性。在此基礎(chǔ)上,成功構(gòu)建了pRN

4、AT-U6.1-siRhoC干擾表達(dá)載體,并將其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至食管癌EC9706細(xì)胞中,以建立RhoC基因“敲弱”(knockdown)的細(xì)胞模型,運(yùn)用boyden chamber侵襲實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞體外侵襲力的改變；采用Westernblot、RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)及原位雜交等實(shí)驗(yàn)方法檢測了轉(zhuǎn)染前后RhoC蛋白及mRNA的表達(dá)變化；同時(shí)采用免疫組化法檢測了干擾RhoC的表達(dá)對(duì)VEGF的影響。最后通過裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn),采用原位雜交、RT

5、-PCR及免疫組織化學(xué)方法檢測裸鼠移植瘤組織中RhoC基因的表達(dá),并采用免疫組織化學(xué)方法檢測移植瘤組織中VEGF的表達(dá),從體內(nèi)角度觀察RhoC基因?qū)β闶笠浦擦龅淖饔眉捌鋵?duì)VEGF表達(dá)的影響,試圖闡明RhoC的表達(dá)在食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展及浸潤、轉(zhuǎn)移中的意義；并進(jìn)一步闡明食管鱗癌中RhoC基因與血管生成之間的關(guān)系,以期為食管癌的靶向治療提供理論依據(jù)。本研究共分以下3個(gè)部分。
　　 第-部分RhoC、VGGF及CD105在食管鱗癌組織中

6、的表達(dá)及其意義
　　 方法：
　　 1.采用RT-PCR、原位雜交、免疫組織化學(xué)等技術(shù)分別檢測RhoC基因在62例食管鱗癌、31例癌旁不典型增生及62例正常食管粘膜組織的表達(dá)情況。
　　 2.采用免疫組化SP法檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)在62例食管鱗癌、31例癌旁不典型增生及62例正常食管粘膜組織中的表達(dá)情況,同時(shí)用CD105抗體檢測食管鱗癌中的微血管密度(MVD)。
　　 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用

7、SPSS13.0軟件處理,采用x2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)和方差分析,并利用Spearman進(jìn)行相關(guān)性分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)it=0.05。
　　 結(jié)果：
　　 1.RhoC mRNA及蛋白陽性表達(dá)主要定位于食管癌細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi),在正常食管粘膜組織內(nèi)無表達(dá)或者表達(dá)量較弱。
　　 2.RT-PCR、原位雜交及免疫組化聯(lián)合檢測RhoC結(jié)果顯示:在正常食管粘膜、癌旁不典型增生和食管鱗癌組織中,RhoC mRNA表達(dá)水平依次升高,三者組間比較

8、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其蛋白的陽性表達(dá)率亦依次升高,三者組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3.在深層浸潤組和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的食管鱗癌組織中,RhoC mRNA、蛋白的表達(dá)顯著高于淺層浸潤組和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,組間比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 4.在Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)食管鱗癌組織中RhoC mRNA、蛋白表達(dá)的結(jié)果顯示,分化程度越低,其陽性表達(dá)越高,組間比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0

9、5)
　　 5.RhoC mRNA、蛋白的表達(dá)與食管癌患者的性別、年齡無關(guān)(P>0.05)。
　　 第二部分pRNAT-U6.1-si RhoC干擾表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)人食管癌細(xì)胞株EC9706細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　 方法：
　　 1.設(shè)計(jì)三對(duì)RhoC基因的反義寡核苷酸片段和一對(duì)無義序列,經(jīng)過退火及酶切后,克隆入RNA干擾表達(dá)載體pRNAT-U6.1,體外擴(kuò)增純化后,得到重組構(gòu)建的pRNAT-U6.1

10、-siRhoC干擾表達(dá)載體。
　　 2.通過脂質(zhì)體2000介導(dǎo)將pRNAT-U6.1-siRhoC干擾表達(dá)載體轉(zhuǎn)染食管鱗癌EC9706細(xì)胞,利用G418篩選穩(wěn)定表達(dá)株。
　　 3.采用PCR、Western-blot、原位雜交、免疫細(xì)胞化學(xué)等技術(shù),檢測轉(zhuǎn)染pRNAT-U6.1-siRhoC1的EC9706細(xì)胞內(nèi)RhoC表達(dá)水平的變化。
　　 4.采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù),檢測轉(zhuǎn)染pRNAT-U6.1-siRhoC1的

11、EC9706細(xì)胞內(nèi)VEGF表達(dá)水平的變化。
　　 5.應(yīng)用Boyden Chamber細(xì)胞體外遷徙力實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染pRNAT-U6.1-siRhoC1 EC9706細(xì)胞侵襲特性的變化。
　　 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用SPSS11.0軟件處理,采用x2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)和方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　 結(jié)果：
　　 1.PCR鑒定結(jié)果表明成功構(gòu)建了三個(gè)siRNA表達(dá)載體pRNAT-U6.1-siRhoC1,pR

12、NAT-U6.1-siRhoC2和pRNAT-U6.1-siRhoC3,并篩選出抑制效果最佳的siRNA表達(dá)載體pRNAT-U6.1-siRhoC1。
　　 2.在轉(zhuǎn)染pRNAT-U6.1-siRhoC1組EC9706細(xì)胞內(nèi)RhoC表達(dá)水平顯著低于無關(guān)siRNA對(duì)照組(轉(zhuǎn)染pRNAT-U6.1-siC)及未轉(zhuǎn)染組(P<0.05)。
　　 3.在轉(zhuǎn)染pRNAT-U6.1-siRhoC1組的EC9706細(xì)胞內(nèi)VEGF表達(dá)水平

13、顯著低于無關(guān)siRNA對(duì)照組(轉(zhuǎn)染pRNAT-U6.1-siC)及未轉(zhuǎn)染組(P<0.05)。
　　 4.Boyden chamber體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:pRNAT-U6.1-siRhoC1轉(zhuǎn)染組EC9706細(xì)胞穿越Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05),而無關(guān)siRNA對(duì)照組(轉(zhuǎn)染pRNAT-U6.1-siC)及未轉(zhuǎn)染組EC9706穿越Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)無明顯差異(P>0.05)。
　　 第三部分p

14、RNAT-U6.1-si RhoC干擾表達(dá)載體對(duì)裸鼠移植瘤生長的影響
　　 方法：
　　 1.分別將pRNAT-U6.1-siRhoC1轉(zhuǎn)染組、無關(guān)siRNA對(duì)照組及未轉(zhuǎn)染組的食管癌細(xì)胞株EC9706注入裸鼠皮下,比較各組裸鼠的成瘤情況及腫瘤大小。
　　 2.分別應(yīng)用RT-PCR、原位雜交、免疫組織化學(xué)方法檢測各組裸鼠移植瘤組織中RhoC基因的表達(dá)情況。
　　 3.應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測各組裸鼠移植瘤組

15、織中VEGF基因的蛋白表達(dá)情況。
　　 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用SPSS13.0軟件處理,采用x2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)和方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　 結(jié)果：
　　 1.在無關(guān)siRNA對(duì)照組及未轉(zhuǎn)染組中,其裸鼠移植瘤的體積顯著大于pRNAT-U6.1-siRhoC1轉(zhuǎn)染組,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 2.在無關(guān)siRNA對(duì)照組及未轉(zhuǎn)染組裸鼠移植瘤組織內(nèi),RhoC蛋白及mRNA的表達(dá)均

16、顯著高于pRNAT-U6.1-siRhoC1轉(zhuǎn)染組的表達(dá),組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3.在無關(guān)siRNA對(duì)照組及未轉(zhuǎn)染組裸鼠移植瘤組織內(nèi),VEGF的蛋白表達(dá)顯著高于pRNAT-U6.1-siRhoC1轉(zhuǎn)染組的表達(dá),組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.食管鱗癌組織中RhoC蛋白及mRNA均呈明顯的高表達(dá),且與食管鱗癌的浸潤轉(zhuǎn)移及組織學(xué)分級(jí)密切相關(guān),提示Rho

17、C可能是食管鱗癌侵襲、轉(zhuǎn)移的重要生物學(xué)標(biāo)記。
　　 2.食管鱗癌組織中,RhoC的高表達(dá)可上調(diào)VEGF的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)腫瘤血管的生成。
　　 3.成功構(gòu)建了pRNAT-U6.1-siRhoC1干擾載體,并將其導(dǎo)入食管鱗癌細(xì)胞株EC9706細(xì)胞中,成功建立了RhoC基因沉默的細(xì)胞株,為進(jìn)一步研究RhoC的生物學(xué)功能和RhoC的靶向治療奠定了基礎(chǔ)。
　　 4.體外實(shí)驗(yàn)顯示,pRNAT-U6.1-siRhoC1可降低E