粘質(zhì)沙雷氏菌殺蟲(chóng)蛋白的分離純化及其基因的克隆與表達(dá)研究.pdf

1、粘質(zhì)沙雷氏菌殺蟲(chóng)蛋白的分離純化及其基因的克隆與表達(dá)研究陶 科博士學(xué)位論文四川大學(xué)2 0 0 6四川大學(xué)博士學(xué)位論文蟲(chóng)蛋白的殺蟲(chóng)活性和蛋白酶活性，而P M S F 沒(méi)有影響，表明殺蟲(chóng)蛋白是一種金屬蛋白酶。同時(shí)，測(cè)定純化的殺蟲(chóng)蛋白N 一端1 8 個(gè)氨基酸序列為M e t G i nS e r T h r L y sL y sA l al i e uG l uI l e uT h r G l uS e r G l uL e u A l aA

2、l aA l a ，與來(lái)源于粘質(zhì)沙雷氏菌S M 6 和沙雷氏菌E 1 5 的金屬蛋白酶N 一端1 8 4 “ 氨基酸序列具有很強(qiáng)的相似性，進(jìn)一步證明該殺蟲(chóng)蛋白是金屬蛋白酶。殺蟲(chóng)蛋白對(duì)蝗蟲(chóng)的毒力研究結(jié)果顯示，其毒力回歸方程為y = 1 ．0 9 0 7 + 0 ．5 9 6 0 x ，致死中濃度L C 5 0 = 1 ．0 9 0 7 ( O ．7 3 4 8 —1 ．4 4 6 5 ) P ．g ，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也說(shuō)明了純化的殺蟲(chóng)蛋白的量增加

3、，即金屬蛋白酶酶液濃度增高，殺蟲(chóng)活性越強(qiáng)。粘質(zhì)沙雷氏菌H R 一3 發(fā)酵上清液加入1 0m m o l ／L 的E D T A 和1 0m m o l ／L1 —1 0 ．p h e n a n t h r o l i n 后，沒(méi)有檢測(cè)到蛋白酶活性，說(shuō)明發(fā)酵上清液中只含有一種蛋白酶，即金屬蛋白酶，且已知金屬蛋白酶酶液濃度越高，殺蟲(chóng)活性越強(qiáng)，因此可以用粘質(zhì)沙雷氏菌H R 一3 的蛋白酶活力，加上菌體生長(zhǎng)量來(lái)作為參照標(biāo)準(zhǔn)來(lái)進(jìn)行粘質(zhì)沙雷氏菌H

4、 R 一3 發(fā)酵條件優(yōu)化和進(jìn)行菌種選育。研究起始p H 、培養(yǎng)溫度、時(shí)間、接種量、培養(yǎng)基裝量以及碳氮源對(duì)H R 一3菌體生長(zhǎng)量和蛋白酶酶活的影響，通過(guò)正交試驗(yàn)得到H R 一3 的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：大豆蛋白胨2 ％，蔗糖2 ％，N a C Io ．5 ％，p H 值為7 ．5 。同時(shí)，用C 0 2 激光輻照誘變菌株獲得高產(chǎn)殺蟲(chóng)蛋白的菌株，經(jīng)過(guò)C O ：激光輻射誘變( 激光功率1 0 W ，擴(kuò)束光斑直徑o5 c m ，照射距離2 3 c

5、 m ，照射時(shí)間3 0 s ) ，選育出高產(chǎn)金屬蛋白酶的菌株粘質(zhì)沙雷氏菌H R 一1 0 ，經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)具有穩(wěn)定的高產(chǎn)金屬蛋白酶活力。本實(shí)驗(yàn)在已證明殺蟲(chóng)蛋白是金屬蛋白酶的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了純化的殺蟲(chóng)蛋白作為金屬蛋白酶的一些酶學(xué)性質(zhì)。動(dòng)力學(xué)方法測(cè)得該酶的最適p H 值7 ．5 ，最適溫度為4 0 。C ，對(duì)熱較為穩(wěn)定。z n ”、C u 2 + 離子對(duì)酶活有不同程度的抑制作用；M n ”、C a ”、M 9 2 離子對(duì)酶活有不同程