嗜線蟲致病桿菌殺蟲蛋白的分離純化及殺蟲蛋白基因克隆.pdf

1、該研究利用大蠟螟和黃粉蟲土壤誘集法,從河北省各地的719份土樣中的28份誘集到了昆蟲病原線蟲,有線蟲率為3.89％.經(jīng)初步鑒定25個(gè)為異小桿屬線蟲(Heterorhabditis)、3個(gè)為斯氏屬線蟲(Steinernema).土樣有線蟲率與植被有關(guān).以果園內(nèi)最高,為8.64%,其次為菜地7.27%,雜草等未耕地為3.28%,大田作物為1.68%.通過取被感染大蠟螟血淋巴涂平板的方法,分別從這28個(gè)線蟲品系中分離出28個(gè)共生菌菌株.對(duì)從河

2、北省分離的28個(gè)菌株和4個(gè)本室保存的菌株的部分16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序,與共生菌已知種的同源序列進(jìn)行比較分析,構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹,初步確定了這32個(gè)共生菌的分類地位.從河北省分離到的發(fā)光光桿菌大部分與P. luminescens關(guān)系密切,歸屬于三個(gè)亞簇.其中HB89和HBgy相似性達(dá)100%,二者與P. luminescens laumondii亞種相似性達(dá)99%.HB310菌株的Ⅰ型菌與Ⅱ型菌部分16S rDNA序列的相

3、似性是100%.但是HB310菌株的Ⅰ型菌與Ⅱ型菌的形態(tài)特點(diǎn)、生理生化指標(biāo)測定及殺蟲活性存在較大的差異.X.nematophila HB310、Srio、HBml、A24和P.luminesense HB202、D1、HBgy等多株共生菌對(duì)棉鈴蟲和小菜蛾等有較高的口服胃毒活性,其中X.nematophila所有品系的殺蟲活性均高于其它種類的菌株.不同屬、種及同種不同品系的共生菌對(duì)同種昆蟲的胃毒活性差別很大,同一菌株對(duì)不同昆蟲的毒力差別也

4、較大.對(duì)HB310菌株殺蟲活性的深入研究表明,該菌的殺蟲譜較廣,對(duì)鱗翅目和鞘翅目的10種昆蟲都有胃毒活性,特別是小菜蛾、菜粉蝶、云斑粉蝶和馬鈴薯二十八星瓢蟲等幼蟲有很強(qiáng)的胃毒活性,其發(fā)酵液對(duì)四種幼蟲在72 h的致死率達(dá)到100%.對(duì)棉鈴蟲、甜菜夜蛾、玉米螟等幼蟲的生長有很強(qiáng)的抑制作用.HB310菌株在對(duì)數(shù)生長初期已開始產(chǎn)生殺蟲毒素,在對(duì)數(shù)生長中后期(15h)其殺蟲活性已達(dá)到最高.HB310菌株發(fā)酵液中的細(xì)胞和胞外上清蛋白提取物中都含有較

5、強(qiáng)的血腔注射殺蟲活性物質(zhì)和口服胃毒素.通過native-PAGE從胞內(nèi)蛋白提取物中分離出2種有胃毒活性的蛋白組份(toxinⅠ和toxin Ⅱ)和1種血腔注射活性的蛋白組份(toxinⅢ),同時(shí)從胞外蛋白提取物中也分離到這三種毒素.SDS-PAGE電泳圖譜顯示兩種胃毒素分別含有3~4個(gè)多肽,而血腔毒素只看到一條帶,可能是一種單體蛋白.純化的血腔毒素對(duì)5齡大蠟螟幼蟲血腔注射LD50為181.5 ng/頭.血腔毒素耐70°C處理10 min