嗜線蟲致病桿菌北京變種CB6菌株殺蟲蛋白的分離和純化.pdf

1、中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文嗜線蟲致病桿菌北京變種CB6菌株殺蟲蛋白的分離和純化姓名：楊保軍申請學位級別：碩士專業(yè)：農(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲防治指導教師：楊懷文20050601A b s t r a c tX e n o r h a b d u sn e m a t o p h i l av f f f ．p e k i n g e n s i ss t r a i nC B 6 i s as y m b i o t i cb a c t e r

2、i u mt h a tw a sf i r s t l yi s o l a t e df r o mt h eg u to f i n s e c tp a r a s i t i cn e m a t o d eS t e i n e r n e m ac a t p o c a p o s a ec o l l e c t e df r o ms o i lo fs u b u r bo f B e i j i n g ，C h

3、 i n a ．I th a sb e e ni d e n t i f i e da n d n o m i n a t e d ．T h ep r e v i o u sr e s e a r c h e ss h o w e dt h a tt h i ss t r a i nh a da h i g hi n s e c t i c i d a la c t i v i t y ．T oe x p l o r et h i si

4、 n d i g e n o u sb a c t e r i a lr e s o u r c e ，i nt h i sp a p e r ,t h e i n s e c t i c i d a l a e t i v i t y o f 丑n e m a t o p h i l av a t ．p e l d n g e n s i s w a s c o m p a r e d 、Ⅳi m t h a t o f o t h

5、e r 9e n t o m o p a t h o g e n i en e m a t o d es y m b i o t i cb a c t e r i a ．T h e e x t r a e e l l u l a re n di n t r a c e l l u l a r p r o d u c t s o f 1 0s t r a i n sw e r ei s o l a t e d ，t h es o l u

6、b l ep r o t e i n so f e a c hp r o d u c t sp r e p a r e d ，a n dt h e i ra c t i v i t yb i o a s s a y e d ．I tw a si n d i c a t e dt h a t 丑n e m a t o p h i l a v a t ．p e k i n g e n s i sc o u l d p r o d u c e

7、p r o t e i n s 謝血ac o m p a r a t i v e l yh i 吐i n s e e t i c i d a la e t i v i t y ．T h e nt h ei n s e c f i c i d a tp r o t e i n so f b o t h e x t r a e e l l u l a ra n d i n t r a c e l l u l a rs e c t i o n

8、 so f t h i ss t r a i n w e r ef u r t h e rp u r i f i e d ，s o m et e c h n i c a lp a r a m e t e r sf o rp u r i f i c a t i o n o f t h i s a c t i v e p r o t e i nw e r ee s t a b l i s h e d ．a(chǎn) n d s o m eo fi t

9、 s c h a r a c t e r i s t i c s w e r ep r e l i m i n a r i l ya n a l y z e d ，T h er e s u l t s w o e a s t h ef o l l o w i n g s ：1 ．T h e f e r m e n t a t i o nc u l t u r e so f1 0s t r a i n sh a do r a lt o x

10、 i c i t i e sa g a i n s tn e o n a t a ll a r v a eo f s p o d o p t e r ae x i g u aa n d H e l i c o v e r p aa r m i g e r a ．’n l ea c t i v es u b s t a n c e sw e r ep r o d u c e df r o mb o t he x t r a e e l l

11、 u l a ra n di n t r a c e l l u l a rs e c t i o n s ．T h ei n s e c t i c i d a la c t i v i t i e so f d i f f e r e n ts t r a i n sa n d d i f f e r e n t p a r t so f af e r m e n t a t i o nc u l t u r ef r o mo n

12、 es t r a i nw e r ed i v e r g e n t ．A n d ，i ng e n e r a l ，e f f e c to f i n t r a c e l l u l a rp r o d u c t sw a ss t r o n g e rt h a nt h a to f e x t r a c e l l u l a ro n e s ．T h eb i o a s s a yr e s u l

13、 t ss h o w e dt h a tt h em a i ni n s e c t i c i d a ls u b s t a n c e so ft h e s e1 0 t e s t i n gs t r a i n sw e r e p r o t e i n s ．2 ． A t e c h n i c a lp r o t o c o lw a se s t a b l i s h e dt o e f f i c

14、 i e n t l yp u r l f yt h ei n s e c t i c i d a l p r o t e i n s o fs t a i nXn e m a t o p h i l a v a t ．p e k i n g e n s i s ．S o m e p a r a m e t e r s i n c l u d e d ：S a l t i n g - O u t ：t h e o p t i m i z

15、 e d s a t u r a t i o n o f a m i n i u m s u l p h a t e i s2 0 - 5 0 ％，I o nE x c h a n g eC h r o m a t o g r a p h y ：、析t hD E A E S e p h a r o s eF F c o l u m n ．t h el o ws a l tf o re l u t i n gi s2 5 r a M 孫“

16、H C I ( p n 7 ．4 ) ，a n dt h eh i 曲s a l t i s 1 m o l ／L N a C l ．1 1 l er i n s i n g v o l u m e f o r h i g l ls a l ti sa tt h e r a n g e o f 1 5 - 3 0 ％．H y d r o p h o b i eC h r o m a t o g r a p h y ：w i t hB u

17、 t y lF F c o ] t r a m ，t h eh i g h s a l tf o re l u t i n gi s3m o l ／L N a C ]+ 2 5 r a M T r i s - H a ( p n 7 ．4 ) ，a n dt h e l o w s a l ti s2 5 r a M T r i 8 - H C I ( p n 7 ．4 ) ，a n dG e lF i l t r a t i o n

18、：w i t hS e p h a c r y lS - 2 0 0l6 ／l Oc o l u m n ．t h ee l u t i n gb u f f e ri s 2 5 r a M1 H s - H C l ( p H7 ．4 1 ，W i t ht h ep r o t o c o la b o v e ，t h ec o n c e n t r a t i o no f t a r g e tp r o t e i np

19、 u r i f i e dw a s4 ．1 3 4 p , g ／m L ，w h o s eg r o w t h i n h i b i t o r y p e r c e n t a g e a g a i n s tH a r m i g e r a l a r v a ew a s 9 7 ．9 ％．3 ． N a t i v e - P A G E r e s u l tr e v e a l e dt h a tt h

20、 em o l e c u l a r w e i g h to f t a r g e tp r o t e i n sf r o m b o t he x t r a c a l l u l a ra n d i n t r a c e l l u l a rs e c t i o n so f s t a i n X ．n e m a t o p h i l a v a t ．p e l a ' n g e n s i s

21、 w e r e h i g h e r t h a n 6 6 9 k D ，a n d t h e y h a dt h e s a n l em i g r a t i o n l o c a t i o n ．W 曲S D S - P A G E ．o n l y a2 2 0 k D b a n d w a g p r e s e n t e d f o r e a c ho f t h e s e t w ot a r g

22、e tp r o t e i n s ．T h i si n d i c a t e dt h ep o s s i b i l i t yt h a tt h et a r g e tp r o t e i nf r o me x t r a c e l l u l a rs e c t i o nw a st h es a m e a st h a tf r o m i n t r a c e l l u l a r o n e ．

23、4 ． T h et a r g e t p r o t e i nw a sf l u c t u a t e d o nt h ew a v e l e n g t hb e t w e e n2 5 0 - 2 9 0 n m ．w h i c hm e a n tt h ec o m p l e x i t yo f t h i s p r o t e i n ．S t a i n i n ge x p e r i m e n

24、t ss h o w e d t h a t ，t h i st a r g e tp r o t e i nw a s n e i t h e rl i p o p r o t e i nn o r g l y o o p r o t e i n ．I nc o n c l u s i o n ．i t w a ss h o w n t h a t t h e a c t i v e i n s e c t i e i d a ls