嗜線蟲(chóng)致病桿菌HB310菌株pirA和pirB基因的克隆表達(dá)及特性的研究.pdf

1、嗜線蟲(chóng)致病桿菌HB310菌株(Xenorhabdus nematophila HB310，Xn HB310)是本實(shí)驗(yàn)室從小卷蛾斯氏線蟲(chóng)中分離得到的一種具有廣譜殺蟲(chóng)和抑菌活性的昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)共生細(xì)菌。本研究利用非變性凝膠電泳native-PAGE切膠回收方法從Xn HB310胞內(nèi)總蛋白中通分離得到了一種對(duì)大蠟螟具有血腔注射活性的PirB蛋白，經(jīng)室內(nèi)測(cè)定該蛋白對(duì)5齡大蠟螟幼蟲(chóng)血腔注射毒力LD50為13.92ng/頭。
　　在X.nema

2、tophila基因組序列的pirB基因附近我們也發(fā)現(xiàn)了pirA基因，為了深入的了解pirB基因的特性以及它和pirA基因之間的關(guān)系，我們根據(jù)質(zhì)譜鑒定結(jié)果和GenBank上已登錄的X.nematophila ATCC19061基因組信息設(shè)計(jì)引物克隆了XnHB310中pirA和pirB基因，分別構(gòu)建了克隆載體pMD18-T-pirA和pMD18-T-pirB，通過(guò)基因測(cè)序獲得pirA和pirB全長(zhǎng)基因序列。對(duì)測(cè)序得到基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分

3、析顯示，pirA基因完整開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)408bp，編碼135個(gè)氨基酸，PirA蛋白理論分子量為14.9kDa，等電點(diǎn)為5.0，為水溶性蛋白，該蛋白不含信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，PirA蛋白有82.6％的概率定位于細(xì)胞核;pirB基因完整開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)1290bp，編碼429個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)理論分子量為48.2kDa，等電點(diǎn)為5.0，為水溶性蛋白，該蛋白存在跨膜結(jié)構(gòu)，但是不含信號(hào)肽，含有類似Bt Endotoxin內(nèi)毒素結(jié)構(gòu)域和Jacalin_

4、like凝集素結(jié)構(gòu)域，PirB蛋白有69.6％的概率定位于細(xì)胞核，21.7％的概率定位于線粒體，8.7％的概率定位于細(xì)胞質(zhì)。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示PirA蛋白不含有α螺旋，含有12個(gè)β折疊;PirB蛋白含有8個(gè)α螺旋和12個(gè)β折疊。最后通過(guò)同源建模在線軟件構(gòu)建了PirA和PirB蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。
　　為明確PirA和PirB蛋白的生物活性以及這兩個(gè)蛋白之間的關(guān)系，分別構(gòu)建了pET28a-pirA和pET28a-pirB原核表達(dá)載體，

5、并且將pirA和pirB基因通過(guò)柔性接頭(GSGSGSGS)連在一起構(gòu)建了pET28a-pirAB原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)得到了17kDa的重組蛋白PirA、48 kDa的重組蛋白PirB和64 kDa的重組融合蛋白PirAB-fusion。利用親和層析技術(shù)對(duì)表達(dá)的三種重組蛋白進(jìn)行了純化，將純化的重組蛋白對(duì)5齡大蠟螟進(jìn)行血腔活性測(cè)定，結(jié)果表明單獨(dú)表達(dá)的重組PirA和PirB蛋白以及Pir