家蠶病原粘質(zhì)沙雷氏菌無(wú)色素突變株的鑒定及致病性的研究.pdf

1、粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）是一種在自然界中廣泛分布的革蘭氏陰性桿菌，屬于變形菌門、腸桿菌科、沙雷氏菌屬。粘質(zhì)沙雷氏菌是節(jié)肢動(dòng)物及部分脊椎動(dòng)物的條件致病菌，可導(dǎo)致脊椎動(dòng)物組織感染或造成昆蟲等節(jié)肢動(dòng)物罹患致死性敗血病。在蠶桑業(yè)中，粘質(zhì)沙雷氏菌是家蠶的主要病原細(xì)菌之一，感染后可發(fā)生急性敗血癥并在較短時(shí)間內(nèi)導(dǎo)致家蠶死亡，稱為靈菌敗血病。粘質(zhì)沙雷氏菌可產(chǎn)生一種紅色的次生代謝產(chǎn)物即靈菌紅素，病蠶死亡后體表出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，進(jìn)

2、而布滿整個(gè)蠶體，產(chǎn)業(yè)上通常以此作為靈菌敗血癥的判定依據(jù)。靈菌紅素具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗原蟲、抗瘧疾、抗腫瘤及免疫抑制等多種生物學(xué)活性，但其對(duì)粘質(zhì)沙雷氏菌的生理活性和意義目前仍不十分明了。
　　有研究表明病原微生物產(chǎn)生的色素通常會(huì)影響其感染力及致死力，但目前仍不清楚粘質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)生的靈菌紅素會(huì)否影響其對(duì)家蠶的毒力。本研究通過(guò)連續(xù)傳代分離，從產(chǎn)靈菌紅素的家蠶病原粘質(zhì)沙雷氏菌野生型菌株SM-R分離紅色素衰退的突變株SM-R2以及不產(chǎn)色素

3、的突變株SM-RW、SM-WW并采用16S rDNA分析驗(yàn)證。研究進(jìn)一步將不同突變菌株感染健康家蠶，以野生型菌株為陽(yáng)性對(duì)照，以大腸桿菌為陰性對(duì)照，對(duì)其感染力和致死力進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1.菌株SM-R2、SM-RW和SM-WW的分離和驗(yàn)證
　　粘質(zhì)沙雷氏菌野生型菌株SM-R經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)后偶有觀察到產(chǎn)色素能力衰退的淡紅色菌落以及完全不產(chǎn)色素的白色菌落。重新分離后菌落形態(tài)仍呈圓形、微凸，表面光

4、滑、邊緣整齊，除顏色外與野生型菌株一致。通過(guò)革蘭氏染色鑒定為陰性桿菌，無(wú)芽孢，顯微形態(tài)與野生型菌株一致。進(jìn)一步分析突變菌株的16SrDNA結(jié)果顯示菌株SM-R2、SM-RW和SM-WW確為粘質(zhì)沙雷氏菌。
　　2.粘質(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素關(guān)鍵基因pigC的擴(kuò)增分析
　　在粘質(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素途徑中，最后一步是2-methyl-3-pyrrole(MAP)和4-methoxy-2，2'-bipyrrole-5-carbald

5、ehyde(MBC)的縮合，因此pigC酶是整個(gè)合成途徑中的限速酶。有報(bào)道顯示pigC在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下容易發(fā)生突變，特別是片段缺失將直接導(dǎo)致不產(chǎn)色素。本研究擴(kuò)增并分析了3個(gè)突變菌株的pigC基因，初步探討家蠶病原粘質(zhì)沙雷氏菌SM-R無(wú)色素突變菌株的突變類型。
　　3.粘質(zhì)沙雷氏菌對(duì)家蠶的致病力研究
　　為研究靈菌紅素對(duì)家蠶病原粘質(zhì)沙雷氏菌致病力的影響，本研究將不同突變菌株經(jīng)注射感染五齡健康家蠶，以野生型菌株為陽(yáng)性對(duì)照，大腸

6、桿菌為陰性對(duì)照，并單獨(dú)調(diào)查了靈菌紅素對(duì)家蠶的毒性。結(jié)果顯示，野生型菌株與3個(gè)突變株均能導(dǎo)致家蠶罹患急性敗血病并迅速致死，但突變菌株并不導(dǎo)致病死蠶體變紅，即使培養(yǎng)至蠶體發(fā)黑也未觀察到任何紅色斑點(diǎn)。菌株SM-R、SM-R2、SM-RW和SM-WW對(duì)家蠶的半數(shù)致死劑量(50％ lethal dosage，LD50)分別為50.9±5.2、46.9±7.7、54.7±5.5和54.4±3.2，統(tǒng)計(jì)分析表明差異不顯著。此外，菌株SM-R、SM-R

7、2、SM-RW和SM-WW對(duì)家蠶的半數(shù)致死時(shí)間(50％ lethal time，LT50)分別為23.5±2.4、24.6±1.1、24.3±1.5和24.1±1.7，差異不顯著。飼喂靈菌紅素（10 mg/頭）或注射靈菌紅素（16.15μg/頭）不表現(xiàn)出任何急性毒性，靈菌紅素與SM-WW共注射也不會(huì)增強(qiáng)無(wú)色素突變株致死力。據(jù)此，本研究發(fā)現(xiàn)家蠶病原粘質(zhì)沙雷氏菌的無(wú)色素突變株同樣可導(dǎo)致急性敗血癥，感染力和致死力與野生型菌株基本一致，因此靈菌