粘質(zhì)沙雷氏菌在太空飛行后變化的初步研究.pdf

1、目的:細菌會隨著人類或航天器部件進入太空,有研究表明細菌在空間環(huán)境作用下毒力增強,然而,關于這一效應的普遍性及機制尚未完全闡明。粘質(zhì)沙雷氏菌是一種常見的臨床條件致病菌,曾在空間站多次檢出。本研究利用神舟八號飛船搭載的機會,采用表型研究相關實驗,并利用比較基因組學、轉(zhuǎn)錄組學以及蛋白質(zhì)組學的生物信息學方法探索粘質(zhì)沙雷氏菌經(jīng)歷了空間飛行環(huán)境作用后的變化,并初步探討其機制。
　　方法:(1)粘質(zhì)沙雷氏菌通過神舟八號飛船搭載獲得空間飛行實驗

2、組,地面設同步溫度對照組,實驗組及對照組均經(jīng)過16SrDNA進一步驗證。(2)通過革蘭氏染色、紙片法耐藥實驗、溶血實驗、生長曲線測定,Biolog法對空間飛行粘質(zhì)沙雷氏菌株和地面對照菌株進行形態(tài)、耐藥性、溶血性、生長速率、生化代謝譜的觀察比較,明確空間飛行株的生物學特性,并獲得粘質(zhì)沙雷氏菌變異株LCT-SM166、LCT-SM262、地面對照株為LCT-SM213。(3)采用高通量Illumina測序技術(shù)對樣品LCT-SM166、LCT

3、-SM262、LCT-SM213進行Paired-End測序。對產(chǎn)出的數(shù)據(jù)進行Denovo組裝,并進行基因預測及注釋分析。對空間變異菌株和地面對照菌株進行比較基因組學分析,包括進化分析、共線性及重排分析、質(zhì)粒鑒定及差異分析、SNP分析及注釋、InDel差異分析及注釋、CorePan分析等。(4)采用Illumina HiSeq2000進行轉(zhuǎn)錄組測序。對下機的數(shù)據(jù)進行測序評估、基因表達注釋、預測新轉(zhuǎn)錄本等分析,基因表達量的計算使用RPKM

4、法,差異表達分析找出表達量在不同樣本間存在差異的基因,差異表達基因定義為FDR≤0.001且倍數(shù)差異在2倍以上的基因。對差異表達基因進行模式聚類、GO和KEGG pathway功能富集分析。(5)使用iTRAQ蛋白組學技術(shù)對LCT-SM166、LCT-SM262、LCT-SM213進行蛋白質(zhì)的鑒定,定量。根據(jù)差異倍數(shù)1.2倍和P<0.05的標準,篩選經(jīng)過空間飛行的粘質(zhì)沙雷氏菌LCT-SM166、LCT-SM262相對于地面對照株LCT-

5、SM213具有顯著差異表達的蛋白。并對這些蛋白進行CO、COG和KEGG功能分析、聚類分析和富集分析。
　　結(jié)果:(1)利用16SrDNA鑒定到36株粘質(zhì)沙雷氏菌,空間飛行株為32株,地面對照株為4株。(2)32株空間飛行株和4株地面對照株比較,對所選抗生素(包括青霉素G、氨芐青霉素、頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢三嗪、阿奇霉素、環(huán)丙沙星、潔霉素、萬古霉素、復方新諾明、氯霉素、舒普深、丁胺卡那、鏈霉素、美滿霉素、美羅培南、哌拉西林/他唑

6、巴坦)均敏感,均未見溶血反應,Biolog實驗顯示生化代謝譜有差異,篩選出差異較大的兩株變異株LCT-SM166和LCT-SM262,地面對照株為LCT-SM213。主要表現(xiàn)為:地面對照株D-棉子糖(D-Raffinose)陰性,而空間搭載株出現(xiàn)顯著陽性反應;地面對照株N-乙酰神經(jīng)氨酸(N-Acetyl neuraminic acid)和D-甘露醇(D-Mannitol)呈弱陽性反應,而兩株空間搭載菌均為陽性反應。變異株的形態(tài)、生長曲線

7、較地面對照株無變化。(3)基于全基因組測序的結(jié)果,以地面對照株LCT-SM213為參考序列,粘質(zhì)沙雷氏菌變異株LCT-SM262、LCT-SM166沒有發(fā)現(xiàn)基因的缺失、重排;SNP差異分析發(fā)現(xiàn)有12個雜合SNP,InDel差異分析、Core Pan分析以及質(zhì)粒差異分析結(jié)果均為陰性。(4)轉(zhuǎn)錄組差異基因表達分析示,同地面對照株LCT-SM213比較,變異株LCT-SM166有6個基因發(fā)生上調(diào),67個基因發(fā)生下調(diào)。變異株LCT-SM262有

8、20個基因發(fā)生上調(diào),5個基因發(fā)生下調(diào)。COG功能注釋顯示這些差異基因大部分都和細菌的代謝相關。(5)差異蛋白組學分析結(jié)果示,同地面對照株LCT-SM213比較,變異株LCT-SM166發(fā)生上調(diào)的蛋白為21個,下調(diào)的蛋白為90個,LCT-SM262發(fā)生上調(diào)的有65個,下調(diào)的有11個,差異蛋白的富集分析顯示兩株誘變株共同的KEGG富集通路有糖酵解/糖異生、丙酮酸鹽代謝、精氨酸和脯氨酸代謝以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解。經(jīng)過聚類分析發(fā)現(xiàn)9個

9、蛋白在兩株細菌中均出現(xiàn)下調(diào)表達,其功能多與細菌的代謝有關系。
　　結(jié)論:(1)神舟八號飛船搭載后返回地面的粘質(zhì)沙雷氏菌,發(fā)生變化的主要表現(xiàn)為對碳源的利用改變,這些變化可能與其空間環(huán)境的適應性生存有關。
　　(2)空間飛行后的粘質(zhì)沙雷氏菌分離出的變異株中檢測到12個經(jīng)過驗證的雜合SNP。
　　(3)轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學分析獲得了差異表達基因(DEG)和差異表達蛋白(DEP),DEG和DEP的富集分析提示這些差異表達的基因