粘質(zhì)沙雷氏菌在太空飛行后變化的初步研究.pdf

1、目的:細(xì)菌會(huì)隨著人類或航天器部件進(jìn)入太空,有研究表明細(xì)菌在空間環(huán)境作用下毒力增強(qiáng),然而,關(guān)于這一效應(yīng)的普遍性及機(jī)制尚未完全闡明。粘質(zhì)沙雷氏菌是一種常見(jiàn)的臨床條件致病菌,曾在空間站多次檢出。本研究利用神舟八號(hào)飛船搭載的機(jī)會(huì),采用表型研究相關(guān)實(shí)驗(yàn),并利用比較基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)以及蛋白質(zhì)組學(xué)的生物信息學(xué)方法探索粘質(zhì)沙雷氏菌經(jīng)歷了空間飛行環(huán)境作用后的變化,并初步探討其機(jī)制。
　　方法:(1)粘質(zhì)沙雷氏菌通過(guò)神舟八號(hào)飛船搭載獲得空間飛行實(shí)驗(yàn)

2、組,地面設(shè)同步溫度對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組均經(jīng)過(guò)16SrDNA進(jìn)一步驗(yàn)證。(2)通過(guò)革蘭氏染色、紙片法耐藥實(shí)驗(yàn)、溶血實(shí)驗(yàn)、生長(zhǎng)曲線測(cè)定,Biolog法對(duì)空間飛行粘質(zhì)沙雷氏菌株和地面對(duì)照菌株進(jìn)行形態(tài)、耐藥性、溶血性、生長(zhǎng)速率、生化代謝譜的觀察比較,明確空間飛行株的生物學(xué)特性,并獲得粘質(zhì)沙雷氏菌變異株LCT-SM166、LCT-SM262、地面對(duì)照株為L(zhǎng)CT-SM213。(3)采用高通量Illumina測(cè)序技術(shù)對(duì)樣品LCT-SM166、LCT

3、-SM262、LCT-SM213進(jìn)行Paired-End測(cè)序。對(duì)產(chǎn)出的數(shù)據(jù)進(jìn)行Denovo組裝,并進(jìn)行基因預(yù)測(cè)及注釋分析。對(duì)空間變異菌株和地面對(duì)照菌株進(jìn)行比較基因組學(xué)分析,包括進(jìn)化分析、共線性及重排分析、質(zhì)粒鑒定及差異分析、SNP分析及注釋、InDel差異分析及注釋、CorePan分析等。(4)采用Illumina HiSeq2000進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。對(duì)下機(jī)的數(shù)據(jù)進(jìn)行測(cè)序評(píng)估、基因表達(dá)注釋、預(yù)測(cè)新轉(zhuǎn)錄本等分析,基因表達(dá)量的計(jì)算使用RPKM

4、法,差異表達(dá)分析找出表達(dá)量在不同樣本間存在差異的基因,差異表達(dá)基因定義為FDR≤0.001且倍數(shù)差異在2倍以上的基因。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行模式聚類、GO和KEGG pathway功能富集分析。(5)使用iTRAQ蛋白組學(xué)技術(shù)對(duì)LCT-SM166、LCT-SM262、LCT-SM213進(jìn)行蛋白質(zhì)的鑒定,定量。根據(jù)差異倍數(shù)1.2倍和P<0.05的標(biāo)準(zhǔn),篩選經(jīng)過(guò)空間飛行的粘質(zhì)沙雷氏菌LCT-SM166、LCT-SM262相對(duì)于地面對(duì)照株LCT-

5、SM213具有顯著差異表達(dá)的蛋白。并對(duì)這些蛋白進(jìn)行CO、COG和KEGG功能分析、聚類分析和富集分析。
　　結(jié)果:(1)利用16SrDNA鑒定到36株粘質(zhì)沙雷氏菌,空間飛行株為32株,地面對(duì)照株為4株。(2)32株空間飛行株和4株地面對(duì)照株比較,對(duì)所選抗生素(包括青霉素G、氨芐青霉素、頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢三嗪、阿奇霉素、環(huán)丙沙星、潔霉素、萬(wàn)古霉素、復(fù)方新諾明、氯霉素、舒普深、丁胺卡那、鏈霉素、美滿霉素、美羅培南、哌拉西林/他唑

6、巴坦)均敏感,均未見(jiàn)溶血反應(yīng),Biolog實(shí)驗(yàn)顯示生化代謝譜有差異,篩選出差異較大的兩株變異株LCT-SM166和LCT-SM262,地面對(duì)照株為L(zhǎng)CT-SM213。主要表現(xiàn)為:地面對(duì)照株D-棉子糖(D-Raffinose)陰性,而空間搭載株出現(xiàn)顯著陽(yáng)性反應(yīng);地面對(duì)照株N-乙酰神經(jīng)氨酸(N-Acetyl neuraminic acid)和D-甘露醇(D-Mannitol)呈弱陽(yáng)性反應(yīng),而兩株空間搭載菌均為陽(yáng)性反應(yīng)。變異株的形態(tài)、生長(zhǎng)曲線

7、較地面對(duì)照株無(wú)變化。(3)基于全基因組測(cè)序的結(jié)果,以地面對(duì)照株LCT-SM213為參考序列,粘質(zhì)沙雷氏菌變異株LCT-SM262、LCT-SM166沒(méi)有發(fā)現(xiàn)基因的缺失、重排;SNP差異分析發(fā)現(xiàn)有12個(gè)雜合SNP,InDel差異分析、Core Pan分析以及質(zhì)粒差異分析結(jié)果均為陰性。(4)轉(zhuǎn)錄組差異基因表達(dá)分析示,同地面對(duì)照株LCT-SM213比較,變異株LCT-SM166有6個(gè)基因發(fā)生上調(diào),67個(gè)基因發(fā)生下調(diào)。變異株LCT-SM262有

8、20個(gè)基因發(fā)生上調(diào),5個(gè)基因發(fā)生下調(diào)。COG功能注釋顯示這些差異基因大部分都和細(xì)菌的代謝相關(guān)。(5)差異蛋白組學(xué)分析結(jié)果示,同地面對(duì)照株LCT-SM213比較,變異株LCT-SM166發(fā)生上調(diào)的蛋白為21個(gè),下調(diào)的蛋白為90個(gè),LCT-SM262發(fā)生上調(diào)的有65個(gè),下調(diào)的有11個(gè),差異蛋白的富集分析顯示兩株誘變株共同的KEGG富集通路有糖酵解/糖異生、丙酮酸鹽代謝、精氨酸和脯氨酸代謝以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解。經(jīng)過(guò)聚類分析發(fā)現(xiàn)9個(gè)

9、蛋白在兩株細(xì)菌中均出現(xiàn)下調(diào)表達(dá),其功能多與細(xì)菌的代謝有關(guān)系。
　　結(jié)論:(1)神舟八號(hào)飛船搭載后返回地面的粘質(zhì)沙雷氏菌,發(fā)生變化的主要表現(xiàn)為對(duì)碳源的利用改變,這些變化可能與其空間環(huán)境的適應(yīng)性生存有關(guān)。
　　(2)空間飛行后的粘質(zhì)沙雷氏菌分離出的變異株中檢測(cè)到12個(gè)經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的雜合SNP。
　　(3)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析獲得了差異表達(dá)基因(DEG)和差異表達(dá)蛋白(DEP),DEG和DEP的富集分析提示這些差異表達(dá)的基因