不同PRRSV毒株的分離鑒定、序列及致病性分析.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome.PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus.PRRSV)引起的一種傳染病，主要造成妊娠母豬繁殖障礙、引發(fā)吮乳仔豬死亡及各生長(zhǎng)階段豬的呼吸道癥狀。該病于1987年首次出現(xiàn)于美國(guó)，目前在世界大部分地區(qū)流行，是豬的主要傳染病之一。我國(guó)在

2、1996年初次報(bào)道分離到PRRSV，至今已經(jīng)過了二十余年的流行和演變。目前豬群中既存在PRRSV經(jīng)典毒株，又有高致病性PRRSV(HP-PRRSV)，且自2012年來類NADC30毒株在我國(guó)各個(gè)省市相繼被發(fā)現(xiàn)，并易與其它毒株發(fā)生重組。然而，現(xiàn)有的PRRSV疫苗，包括經(jīng)典株疫苗和高致病株疫苗，都不能有效的保護(hù)宿主免受類NADC30毒株的危害，且一些高致病性弱毒活疫苗還存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)，加大了對(duì)該病的防控及消除難度。
　　本研究旨在

3、通過對(duì)PRRSV流行毒株的分離鑒定及NSP2、ORF5基因及部分毒株全基因組序列測(cè)定與分析，了解其變異特點(diǎn)、遺傳進(jìn)化及重組情況，揭示田間PRRSV最新流行動(dòng)態(tài)與演變趨勢(shì)，并進(jìn)一步對(duì)不同類型毒株進(jìn)行致病性研究及比較，以期為PRRSV的疫情預(yù)警、臨床診斷、疫苗研發(fā)等提供有力的參考依據(jù)。
　　1.不同PRRSV毒株的分離鑒定
　　為了解田間PRRSV流行毒株的特性，本試驗(yàn)對(duì)2015-2016年采自河南省各地區(qū)的217份疑似PRRS

4、V感染豬只的組織樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)，從中檢測(cè)出陽性樣品54份，陽性率為24.88％。將PRRSV陽性樣品處理后接種Marc-145傳代細(xì)胞，利用接連傳代的方法來分離病毒。并通過RT-PCR和間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行鑒定。結(jié)果從54份陽性樣品中成功分離出10株P(guān)RRSV，包括HP-PRRSV及其疫苗株、類NADC30毒株及其重組株，分別命名為HENZK-1、HENZMD-9、HENXC-4

5、、HENZZ-8、HENXY-2、HENXY-3、HENLY-6、HENNY-4、HENPY-2和HENHB-8，其第5代病毒滴度分別能夠達(dá)到1068TCID50/mL、1067TCID50/mL、10633TCID50/mL、10675TCID50/mL、106TCI D50/mL、10615TCID50/mL、10675TCID50/mL、10653TCID50/mL、1066TCID50/mL和10635TCID50/mL。本試驗(yàn)

6、為研究PRRSV的遺傳進(jìn)化和致病性等方面奠定了基礎(chǔ)。
　　2.不同PRRSV分離株的NSP2、ORF5基因及部分毒株全基因序列測(cè)定及分析
　　利用RT-PCR方法對(duì)分離到的PRRSV毒株的NSP2和ORF5基因進(jìn)行序列測(cè)定及比對(duì)分析。結(jié)果顯示，其中5株（HENZK-1、HENZZ-8、HENLY-6、HENNY-4和HENPY-2）與我國(guó)HP-PRRSV代表毒株JXA1高度相似，其余5株（HENZMD-9、HENXC-4、H

7、ENXY-2、HENXY-3和HENHB-8）的Nsp2蛋白存在131個(gè)氨基酸的不連續(xù)缺失，與美洲毒株NADC30高度相似。分別從兩種類型的毒株里各選擇兩株（HENZK-1、HENZZ-8、HENZMD-9和H ENXC-4）進(jìn)行全基因序列擴(kuò)增、測(cè)定及分析。結(jié)果顯示，HENZK-1、HENZZ-8、HENZMD-9和HENXC-4株全基因長(zhǎng)度分別為:15319bp、15320bp、15017bp和15023bp，不含Poly(A)尾。核

8、苷酸序列的相似性、遺傳進(jìn)化及重組分析結(jié)果顯示，HENZZ-8為HP-PRRSV，HENZK-1為類HP-PRRSV JXA1-R疫苗株，HENXC-4為類NADC30毒株,而HENZMD-9為HP-PRRSV及類NADC30毒株的重組株，因此，這4個(gè)毒株屬于4個(gè)不同類型的毒株。本試驗(yàn)為進(jìn)一步探究PRRSV的田間流行情況、遺傳進(jìn)化規(guī)律和致病性等奠定了基礎(chǔ)，同樣也對(duì)疫苗研發(fā)及使用具有重要的參考價(jià)值。
　　3.不同類型PRRSV分離株的

9、致病性研究
　　為了解不同分離株的致病性，本試驗(yàn)對(duì)4種不同類型的PRRSV分離株（HENZK-1、HENZMD-9、HENXC-4及類HP-PRRSV JXA1-R疫苗株HENPDS-2）進(jìn)行動(dòng)物攻毒試驗(yàn)。結(jié)果顯示，4個(gè)不同PRRSV分離株的致病性由強(qiáng)到弱依次為:HENXC4＞HENZK-1＞HENZMD-9＞HENPDS-2;JXA1-R株商品疫苗毒未表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，與JXA1-R相比，類疫苗株HENZK-1表現(xiàn)出較強(qiáng)的致