血清球蛋白的分離純化與鑒定

1、實(shí)驗(yàn)二 血清γ球蛋白的分離純化與鑒定,層析技術(shù)實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)思路實(shí)驗(yàn)流程及操作注意事項(xiàng),層 析 技 術(shù),1．層析法：又稱色譜法，是一種廣泛運(yùn)用的物質(zhì)分離純化、分析鑒定技術(shù).,2. 依據(jù)：混合物中各組分的理化性質(zhì)差異—吸附力、分子形狀、大小、酸堿性或分子極性、分子親和力以及分配系數(shù)。,固定相—固定不動(dòng)流動(dòng)相—對(duì)固定相作單向相對(duì)運(yùn)動(dòng)，推動(dòng)樣品中各組分通過固定相向前移動(dòng)。各組分理化性質(zhì)不同，對(duì)流動(dòng)相和固定相具有不同的作用力，因此在流動(dòng)

2、相推動(dòng)樣品通過固定相的過程中，通過不斷地吸附、解吸、吸附、解吸作用，造成混合物中各組分在固定相中的遷移距離不等，達(dá)到分離。,3．基本原理：固定相和流動(dòng)相,4．分類：①流動(dòng)相的物理狀態(tài)：氣相和液相→ 氣液/固，液固/液②方式：紙、薄層、柱③原理：吸附、分配、凝膠、離子交換、親和、金屬螯合、疏水、反相,5．凝膠層析(凝膠過濾、凝膠色譜、分子篩層析、分子排阻層析)①定義：指混合物隨流動(dòng)相流經(jīng)固定相的層析柱時(shí)，混合物中各組分按

3、其分子大小不同而被分離的技術(shù)。,②基本原理：固定相：凝膠，惰性三維空間多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，故稱分子篩，包括瓊脂糖、交聯(lián)葡聚糖、聚丙烯酰胺、瓊脂糖-葡聚糖復(fù)合凝膠。流動(dòng)相：洗脫液,交聯(lián)葡聚糖凝膠,多聚葡萄糖與環(huán)氧丙烷交聯(lián)而成，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)珠狀顆粒，商品名為Sephadex G系列G—交聯(lián)度：G后面的阿拉伯?dāng)?shù)字表示不同的規(guī)格型號(hào)，有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200八種，具體含義為凝膠得水值

4、的10倍或吸水量（g）/10g干膠交聯(lián)度與孔徑大小成反比：交聯(lián)度越大，孔徑越小，吸水性小；交聯(lián)度越小，孔徑越大，吸水性大。因此，“G”反映凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分部范圍。,長(zhǎng)鏈狀葡聚糖分子間以環(huán)氧丙烷連接,凝膠層析的基本原理,樣品加于柱上，樣品隨洗脫液的流動(dòng)而向下移動(dòng)，同時(shí)作垂直向下運(yùn)動(dòng)和不定向擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)→小分子可進(jìn)入凝膠空內(nèi)部，流程長(zhǎng)，速度慢，后流出；大分子不能進(jìn)入凝膠空內(nèi)部，顆粒間移動(dòng)，流程短，先流出→大小分子彼此分開,l 分子

5、大小不同混合物上柱； 2 洗脫開始，小分子擴(kuò)散進(jìn)人凝膠顆粒內(nèi)，大分子被排阻于顆粒之外；3 大小分子分開： 4大分子行程較短，已洗脫出層析柱，小分子尚在進(jìn)行中,,,,,,,,,,數(shù)學(xué)模型,Vo Vi Vt,Vi—凝膠孔內(nèi)水（內(nèi)水）Vo—顆粒間水（外水）Vg—凝膠體積總體積Vt= Vi +Vo+Vg,Kd—分配系數(shù)：精確衡量混合物中某一待分離成分在凝膠柱內(nèi)的洗脫行為，反映物質(zhì)分子進(jìn)入凝膠顆粒的程度

6、，是溶質(zhì)分子大小的一個(gè)函數(shù)Ve—洗脫體積：分離物被洗脫時(shí)所用的洗脫液體積 Ve=Vo+Kd·Vi 洗脫曲線：以洗脫體積為橫坐標(biāo)，各物質(zhì)濃度/吸光度為縱坐標(biāo)作圖,,（1）完全被排阻的極端大分子，Ve=Vo，Kd=0（2）中等分子，Ve=Vo+Kd·Vi，01,③影響因素*層析柱的選擇及裝填：柱大小—分離樣品量凝膠型號(hào)—分辨率：各種分子篩的孔隙大小分布有一定范圍，有最大極限和最小極限。凝膠分離范圍之外的分子

7、，難以分離。如大小不同的兩種全排阻分子/完全滲透分子。*洗脫液：溶解待分離物質(zhì)，不變性*加樣量：1%～5%*凝膠的再生,交聯(lián)葡聚糖凝膠層析介質(zhì)的有關(guān)技術(shù)參數(shù),實(shí)驗(yàn)原理,透析及超濾法鹽析、有機(jī)溶劑/免疫沉淀電泳凝膠層析離子交換層析超離心,共性：*生命高分子：透析、超濾、超離心、凝膠層析*蛋白質(zhì)溶液是親水膠體：穩(wěn)定因素為水化膜和電荷→鹽析/有機(jī)溶劑沉淀*兩性電解質(zhì)和等電點(diǎn)：pH> pI，蛋白質(zhì)帶負(fù)電；反之帶正電→

8、電泳、離子交換層析 *有一定的功能：抗原性→ 免疫沉淀 個(gè)性：蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、親水程度、形狀不同,分離依據(jù)：蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的和個(gè)性,,實(shí)驗(yàn)思路,分段鹽析去除雜蛋白,凝膠層析脫鹽,交聯(lián)葡聚糖吸水濃縮,醋酸纖維素薄膜電泳鑒定,,,,,上午完成,下午完成,,先粗后細(xì),①分段鹽析：常用中性鹽：硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。 硫酸銨：溫度系數(shù)小，溶解度大，蛋白譜廣，分段鹽析效果好，不易引起變性。溶

9、液pH約4.5～5.5，可用硫酸/氨水按需要調(diào)節(jié)pH值。分段鹽析：各種蛋白大小、親水程度、pI不同，所需的鹽濃度、pH也不一樣。如清蛋白分子小，親水性強(qiáng)，需高鹽濃度才沉淀，球蛋白分子大，親水性弱，較低鹽濃度即可沉淀。因此調(diào)節(jié)鹽濃度及pH可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。,實(shí)驗(yàn)流程及操作注意事項(xiàng),影響因素：①溫度：溫度與溶解度成正比。一般室溫即可,少數(shù)溫度敏感型蛋白質(zhì)需4度操作，而血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白在25度比0度時(shí)溶解度低，更易鹽析。

10、②pH值：大多數(shù)蛋白質(zhì)在pI時(shí)溶解度最低。pH=pI效果更好。③蛋白質(zhì)濃度：濃度高時(shí)產(chǎn)生共沉。鹽析前血清加等量生理鹽水稀釋，控制蛋白質(zhì)含量在2.5-3.0%。,②凝膠層析脫鹽：常用透析，需時(shí)較長(zhǎng)，最好低溫。也可用葡萄糖凝膠G-25/50過柱，用時(shí)較短。固定相：sephadex G-25流動(dòng)相：pH7.4的0.01M磷酸鹽緩沖液（0.9%NaCl）原理同前，蛋白質(zhì)大分子，硫酸銨小分子。,③濃縮：sephadex G-25吸水，利用

11、高分子性質(zhì)。,注意事項(xiàng)：1．硫酸銨的滴加，邊搖邊逐滴加入2．流洗柱子：3～4個(gè)柱長(zhǎng)3．上樣：轉(zhuǎn)圈滴加，起跑線一致4．防止柱上液層干涸5．洗脫液收集無(wú)需分部，用載玻片檢測(cè)蛋白，無(wú)納氏試劑6．G-25干膠用紙條少量多次加入，液層高<0.5ml7. 用過的G-25干膠倒入收集缸，回收利用。,④鑒定：醋酸纖維素薄膜電泳,電泳：帶電粒子在電場(chǎng)的作用下，向著與其電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。電泳技術(shù)：利用電泳現(xiàn)象對(duì)混合物進(jìn)行分離分

12、析的技術(shù)。電泳系統(tǒng)：電泳支持介質(zhì)、電泳緩沖液、電場(chǎng),COO- COO- COOH╱ + H+ ╱ + H+ ╱Pr ←————→ Pr ←————→ Pr ╲ + OH- ╲ + OH- ╲ NH2 NH3+ NH

13、3+PH>PI PH=PI PH<PI,電泳用于分離物質(zhì)的原理：,蛋白質(zhì)為兩性電解質(zhì)，有一定的等電點(diǎn)，在大于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電，在電場(chǎng)中向陽(yáng)極移動(dòng)，由于各種蛋白質(zhì)的分子大小與結(jié)構(gòu)不同，所帶表面電荷的多少不同，因而在電場(chǎng)中向陽(yáng)極移動(dòng)的速度不同。經(jīng)過一定的電泳時(shí)間后可形成許多蛋白質(zhì)區(qū)帶，每一個(gè)區(qū)帶代表一組遷移率相近似的蛋白質(zhì)。,醋酸纖維素薄膜電泳介質(zhì)：醋酸纖維素薄膜，纖維

14、素的羥基經(jīng)乙?；纬傻睦w維素醋酸酯。溶于有機(jī)溶劑后涂成薄膜，具均一的泡沫狀結(jié)構(gòu)，有強(qiáng)滲透性。 電泳緩沖液：pH8.6的巴比妥緩沖液,,,,,,,,?,?,清蛋白 ?1 ?2 ? ?,清蛋白（albumin，A）：38～48g/L球蛋白（globulin，G）：15～30g/LA/G：正常值1.5～2.5,,,【操作步驟】1．點(diǎn)樣：取經(jīng)巴比妥緩沖液浸透的2×8cm薄膜，濾紙吸去表面多余水分

15、，在無(wú)光澤面距一端2cm處用鉛筆劃一加樣線，寫上編號(hào)。小濾紙片蘸取血清/樣品，垂直壓在加樣線上，待樣品滲入薄膜，無(wú)光澤面向下平貼在電泳槽支架的鹽橋上，靜置5～10分鐘平衡。點(diǎn)樣端置陰極，蓋上蓋子。2．通電：接通電源，調(diào)節(jié)電壓為40～50V，通電2 ～ 2.5h，關(guān)閉電源，停止電泳。3．染色：薄膜浸入氨基黑B染色液2～5分鐘。4．漂洗：取出薄膜在漂洗液中漂洗4～5次，至無(wú)蛋白區(qū)完全脫色為止。取出，用濾紙吸干液體。觀察。,5）醋酸纖維