血清γ球蛋白的分離純化與鑒定

1、實(shí)驗(yàn)三,血清γ球蛋白的分離純化與鑒定,層析技術(shù)（Chromatography),層析法也稱色譜法，是1903年俄國(guó)植物學(xué)家Michael Tswett發(fā)現(xiàn)并命名的。將植物色素溶液通過(guò)裝有CaCO3 吸附劑的柱子，然后用石油醚淋洗，各種色素以不同的速率流動(dòng)后形成不同的色帶而被分開。

2、 用色彩（chroma）和 圖譜（graphs）組成 色譜一詞

3、 （Chromatography),層析技術(shù)（Chromatography),依據(jù)：混合物中各組分的理化性質(zhì)差異—吸附力、分子形狀、大小、酸堿性或分子極性、分子親和力以及分配系數(shù)。,基本原理,固定相—固定不動(dòng)流動(dòng)相—對(duì)固定相作單向相對(duì)運(yùn)動(dòng)，推動(dòng)樣品中各組分通過(guò)固定相向前移動(dòng)。各組分理化性質(zhì)不同，對(duì)流動(dòng)相和固定相具有不同的作用力，因此在流動(dòng)相推動(dòng)樣品通過(guò)固定相的過(guò)程中，通過(guò)不斷地吸附、解吸、吸附、解吸作用，造成混合物中各組分

4、在固定相中的遷移距離不等，達(dá)到分離。,分類,①流動(dòng)相的物理狀態(tài)：氣相和液相→ 氣固/液，液固/液②操作方式：紙、薄層、柱③分離原理：吸附、分配、凝膠、離子交換、親和、金屬螯合、疏水、反相,凝膠層析(凝膠過(guò)濾、凝膠色譜、分子篩層析、分子排阻層析),定義：指混合物隨流動(dòng)相流經(jīng)固定相的層析柱時(shí)，混合物中各組分按其分子大小不同而被分離的技術(shù)。基本原理： 固定相：凝膠，惰性三維空間多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，故稱分子篩，包括瓊脂糖、交聯(lián)葡聚糖、

5、聚丙烯酰胺、瓊脂糖-葡聚糖復(fù)合凝膠。流動(dòng)相：洗脫液,凝膠層析的基本原理,交聯(lián)葡聚糖凝膠,其商品名為Sephadex G系列G—交聯(lián)度：G后面的阿拉伯?dāng)?shù)字表示不同的規(guī)格型號(hào)，有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200八種，具體含義為凝膠得水值的10倍或吸水量（g）/10g干膠。 交聯(lián)度與孔徑大小成反比：交聯(lián)度越大，孔徑越小，吸水性小；交聯(lián)度越小，孔徑越大，吸水性大。,影響因素,*層析柱的

6、選擇及裝填：柱大小—分離樣品量凝膠型號(hào)—分辨率：各種分子篩的孔隙大小分布有一定范圍，有最大極限和最小極限。凝膠分離范圍之外的分子，難以分離。如大小不同的兩種全排阻分子/完全滲透分子*洗脫液：溶解待分離物質(zhì)，不變性*加樣量：1%～5%*凝膠的再生,蛋白質(zhì)的分離依據(jù),生命高分子：透析、超濾、超離心、凝膠層析蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)：穩(wěn)定因素為水化膜和電荷→鹽析/有機(jī)溶劑沉淀兩性電解質(zhì)和等電點(diǎn)：pH> pI，蛋白質(zhì)帶負(fù)電；反之帶正

7、電→電泳、離子交換層析有一定的功能：抗原性→ 免疫沉淀、親和層析,血清γ球蛋白的分離純化與鑒定,,血清,實(shí)驗(yàn)思路,,鑒定：醋酸纖維素薄膜電泳,COO- COO- COOH ╱ + H+ ╱ + H+ ╱Pr Pr Pr ╲ + OH-

8、 ╲ + OH- ╲ NH2 NH3+ NH3+ pH>pI pH=pI pH<pI,,蛋白質(zhì)電泳的原理：,,,,,陽(yáng)離子,兼性離子,陰離子,鑒定：醋酸纖維素薄膜電泳,介質(zhì)：醋酸纖維素薄膜，纖維素的羥基經(jīng)乙?；纬傻睦w維素醋酸酯。溶于有機(jī)溶劑后涂成薄膜，

9、具均一的泡沫狀結(jié)構(gòu)，有強(qiáng)滲透性。 電泳緩沖液：pH8.6的巴比妥緩沖液,鑒定：醋酸纖維素薄膜電泳,,,,,加樣線,加樣線,,,純化蛋白,對(duì)照,樣品,,鑒定：醋酸纖維素薄膜電泳,【操作步驟】1．點(diǎn)樣：取經(jīng)巴比妥緩沖液浸透的2×8cm薄膜，濾紙吸去表面多余水分，在無(wú)光澤面距一端2cm處用鉛筆劃一加樣線，寫上編號(hào)。小濾紙片蘸取血清/樣品，垂直壓在加樣線上，待樣品滲入薄膜，無(wú)光澤面向下平貼在電泳槽支架的鹽橋上，靜置5～10分鐘平

10、衡。點(diǎn)樣端置陰極，蓋上蓋子。2．通電：接通電源，調(diào)節(jié)電壓為40～50V，通電2 ～ 2.5h，關(guān)閉電源，停止電泳。3．染色：薄膜浸入氨基黑B染色液2～5分鐘。4．漂洗：取出薄膜在漂洗液中漂洗4～5次，至無(wú)蛋白區(qū)完全脫色為止。取出，用濾紙吸干液體。觀察。,,,+,,鉛筆標(biāo)記 ，垂直點(diǎn)樣,保持膜不下垂,半干燥態(tài),交聯(lián)葡聚糖凝膠層析介質(zhì)的有關(guān)技術(shù)參數(shù),,長(zhǎng)鏈狀葡聚糖分子間以環(huán)氧丙烷連接,,,分段鹽析,分段鹽析：各種蛋白大小、親水程度、p

11、I不同，所需的鹽濃度、pH也不一樣。如清蛋白分子小，親水性強(qiáng)，需高鹽濃度才沉淀，球蛋白分子大，親水性弱，較低鹽濃度即可沉淀。因此調(diào)節(jié)鹽濃度及pH可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。常用中性鹽：硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。,①溫度：溫度與溶解度成正比。一般室溫即可,少數(shù)溫度敏感型蛋白質(zhì)需4度操作，而血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白在25度比0度時(shí)溶解度低，更易鹽析。②pH值：大多數(shù)蛋白質(zhì)在pI時(shí)溶解度最低。pH=pI效果更好。③蛋白質(zhì)濃

12、度：濃度高時(shí)產(chǎn)生共沉。鹽析前血清加等量生理鹽水稀釋，控制蛋白質(zhì)含量在2.5-3.0%。,影響因素,,分段鹽析,固定相：sephadex G-25流動(dòng)相：pH7.4的0.01M磷酸鹽緩沖液（0.9%NaCl）,,,凝膠層析脫鹽,sephadex G-25吸水，利用高分子性質(zhì)。,濃縮,操作注意事項(xiàng)1．硫酸銨的滴加，邊搖邊逐滴加入2．流洗柱子：3～4個(gè)柱長(zhǎng)3．上樣：轉(zhuǎn)圈滴加，起跑線一致4．防止柱上液層干涸(兩人合作）5．洗脫液收