ABA誘導(dǎo)的OsDMI3基因的表達(dá)分析與亞細(xì)胞定位.pdf

1、脫落酸（abscisic acid，ABA）是一種重要的植物激素，不僅在植物的生長發(fā)育中而且還在植物對各種環(huán)境脅迫反應(yīng)中起重要作用。已有研究表明ABA的作用模式與植物細(xì)胞中氧化脅迫有關(guān)，ABA能夠誘導(dǎo)NADPH氧化酶引起活性氧產(chǎn)生及抗氧化基因的表達(dá)，從而提高植物抗氧化防護(hù)能力。Ca2+/CaM依賴性蛋白激酶（CBK）是一種Ser/Thr類蛋白激酶，在動物中，Ca2+/CaM依賴性蛋白激酶（CaMK）已經(jīng)被很好的研究，迄今人們已在多種植物

2、中分離出大量CBK家族成員，但大多數(shù)植物CBK的功能沒有被闡明，已有的研究提示這一激酶可能參與鹽、低溫、干旱與氧化脅迫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，鑒定ABA誘導(dǎo)的氧化脅迫信號途徑與植物CBK基因的關(guān)系，對于揭示ABA信號的細(xì)胞和分子機(jī)理具有重要的意義。
　　 本實(shí)驗(yàn)以水稻為研究對象，利用生物信息學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法，以半定量RT-PCR為主要研究手段對水稻中一條OsCBK基因OsDMI3與ABA和H2O2的關(guān)系進(jìn)行了研究，并通過構(gòu)建

3、原生質(zhì)體瞬時表達(dá)載體對其進(jìn)行亞細(xì)胞定位，主要結(jié)果如下：
　　 1.用100μmol·L-1 ABA處理4h的時間進(jìn)程結(jié)果顯示，OsDMI3基因在水稻葉片和根中的轉(zhuǎn)錄水平和對照相比，分別表現(xiàn)為30 min和60 min產(chǎn)生上調(diào)表達(dá)高峰之后逐漸降低至接近對照水平。用ABA合成抑制劑fluridon（FLU）預(yù)處理水稻，研究結(jié)果表明：干旱脅迫下，水稻葉片和根中ABA合成受抑制的（FLU處理）與不受抑制的相比，OsDMI3基因的表達(dá)均受

4、到了明顯的抑制，外源施加ABA恢復(fù)后，基本上清除了這種抑制作用。這些結(jié)果初步說明ABA可以上調(diào)OsDMI3的表達(dá)。
　　 2.10mmol·L-1 H2O2處理后，水稻葉片和根中OsDMI3基因的轉(zhuǎn)錄水平和對照相比，在4 h處理時間均產(chǎn)生兩個上調(diào)表達(dá)高峰；為了確定H2O2是否參與了ABA誘導(dǎo)的OsDMI3基因在水稻中的轉(zhuǎn)錄，本研究應(yīng)用H2O2清除劑DMTU和NADPH氧化酶抑制劑DPI濃度分別為100μmol·L-1和10 mm

5、ol·L-1預(yù)處理后的樣品較對照樣品，結(jié)果顯示，當(dāng)ABA處理60min時清除劑和抑制劑預(yù)處理對OsDMI3基因的表達(dá)并沒有明顯的抑制。而當(dāng)ABA處理至60min至90min時，OsDMI3基因在水稻葉片和根中的轉(zhuǎn)錄均受到明顯抑制。證明了ABA誘導(dǎo)水稻OsDMI3基因表達(dá)增強(qiáng)是通過ABA誘導(dǎo)產(chǎn)生的內(nèi)源H2O2來起作用的。這些結(jié)果初步闡明了在ABA信號途徑中ABA、H2O2與植物CBK三者之間的關(guān)系，從而為ABA誘導(dǎo)植物細(xì)胞抗氧化防護(hù)系統(tǒng)的

6、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑提供了新的證據(jù)。
　　 3.通過設(shè)計含有酶切位點(diǎn)的引物和PCR方法，從本實(shí)驗(yàn)室已保存的水稻OsDMI3基因的模板上擴(kuò)增完整的基因編碼區(qū)，并利用DNA重組技術(shù)將OsDMI3基因連到含有35S啟動子的植物瞬間表達(dá)載體pXZP008上，構(gòu)建了全長基因瞬時表達(dá)載體35S-pXZOsDMI3。將表達(dá)載體用PEG方法轉(zhuǎn)化玉米原生質(zhì)體，以黃色熒光蛋白YFP為報告基因，通過激光共聚焦顯微鏡觀察。結(jié)果表明OsDMI3主要定位在玉米的細(xì)