黃瓜CDPK基因的克隆及遺傳轉化.pdf

1、黃瓜是一種重要的世界性蔬菜，黃瓜生產過程中對氮肥的需求量較大。隨著生產者對黃瓜產量和效益追求的不斷提高，在黃瓜生產過程中氮肥施用量就不斷的增加，黃瓜的生產成本不斷提升，造成農民的生產負擔越來越重，而且氮肥施用量的增加還使得黃瓜果實中亞硝酸鹽含量增加，影響黃瓜的品質和人類的健康，并且大量的氮肥揮發(fā)到空氣中污染大氣或隨著雨水流到湖泊、海洋污染水體等造成環(huán)境污染。因此，提高黃瓜品種的耐低氮性，不僅可以有效減少氮肥施用量，降低生產成本，減少對環(huán)

2、境的污染，而且還可以減少黃瓜果實中硝酸鹽的積累，防止對人類健康的危害。
　　 鈣依賴蛋白激酶CDPKs(Calcium-dependent Protein Kinases，CDPKs)，磷酸化蔗糖合成途徑的關鍵酶——蔗糖磷酸合成酶(SPS)和硝酸鹽同化氮素的限速酶——硝酸還原酶(NR)，參與植物的碳氮代謝和抗逆反應。本試驗室前期在對低氮脅迫下黃瓜葉片Solexa測序研究中發(fā)現(xiàn)黃瓜葉片中的CDPK基因在低氮脅迫下表達量增加，推測C

3、DPK基因可能參與了低氮脅迫中某些信號的轉導，提高黃瓜的耐低氮能力。因此，進行黃瓜CDPK基因的克隆及其對黃瓜和擬南芥的轉化，可為揭示該基因在低氮脅迫中的作用機理以及耐低氮黃瓜新種質資源創(chuàng)新奠定基礎。
　　 本試驗通過PCR的方法成功克隆了黃瓜葉片CDPK基因，并對其核苷酸序列與預測的氨基酸序列進行了分析。在此基礎上構建了PBI１21-CDPK植物表達載體。通過農桿菌轉化，獲得過量表達和干擾表達該基因的黃瓜和擬南芥植株。主要研究

4、結果如下:
　　 (1)采用RT-PCR方法從黃瓜品種津研四號葉片中成功克隆得到CDPK基因。CDPK基因編碼區(qū)全長1584bp，編碼527個氨基酸，分子量為60007.514 Da，等電點為5.34。該基因編碼的蛋白是一個穩(wěn)定的親水蛋白，無跨膜結構，無信號肽，存在EF手型鈣結合區(qū)，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點，氮糖基化位點等多個位點。同源比對發(fā)現(xiàn)，黃瓜CDPK基因編碼的蛋白與葡萄、毛果楊、蓖麻CDPK基因編碼蛋白同源性高達7