黃瓜乙烯信號轉導途徑相關基因的克隆分析及黃瓜遺傳轉化體系研究.pdf

1、黃瓜(Cucumis sativus L是葫蘆科(Cucurbitaceae)—年生的草本植物。特別是黃瓜花性型分化多樣,其生理學和遺傳學研究豐富,黃瓜已成為研究植物性型分化的模式材料。
　　乙烯作為一種植物激素對植物的正常發(fā)育和脅迫反應起著很重要的作用。在植株整個發(fā)育過程中,乙烯調控種子的萌發(fā)、種苗的生長、果實的成熟、器官的衰老與脫落、花性別決定等生理過程。在黃瓜上,內源乙烯與黃瓜雌花的形成正相關,被稱為黃瓜的“性激素”,其性別

2、決定基因F和A/基因已經(jīng)被克隆,兩基因都編碼I-氨基環(huán)丙烷-I-羧酸合酶(ACS),其為乙烯生物合成途徑中的限速酶;而與乙烯生物合成途徑相比,黃瓜乙烯信號轉導途徑的相關研究進展十分緩慢,且途徑中的一些關鍵組分基因還未分離。
　　為加強對黃瓜乙烯信號轉導體系的了解,本研究選取黃瓜雌雄異花同株品系S52為研究對象,克隆了3個乙烯信號轉導途徑關鍵成員基因,并在生物信息學分析、表達模式分析、異源表達功能驗證等方面開展了一系列工作,并取得以

3、下結果:
　　1.首次成功克隆出黃瓜乙烯信號轉導途徑中的CONSTITUTIVE TRIPLE及五見(9＃觀7-1丨]^基因(CTi^-Iike)的cDNA序列,命名為CsCTRl。該基因開放閱讀框2559bp,編碼852個氨基酸;位于6號染色體,含有15個外顯子、14個內含子,在基因組中為單拷貝。與其他物種進行氨基酸序列比對及系統(tǒng)進化樹分析顯示,CsCTRl與其他植物C T R l高度同源,在進化過程中起源于同一祖先,且與南瓜、

4、甜瓜聚類在一簇。在擬南芥突變株中異源表達CvCTi"可以恢復正常的乙烯信號轉導,表明CsCTRl的確參與乙烯信號轉導。CsCTRl在根、莖、成熟葉片、頂芽、成熟雌花和成熟雄花、幼果中都有表達,且在成熟雄花中表達量最高,說明CsCTRl呈組成型表達,且具有組織差異性;對不同發(fā)育時期雌花和雄花的表達情況進行分析,結果顯示在5個生長階段,雄花的表達量一直高于雌花。雄花的表達量在Fl時期最高,之后呈降低趨勢。而雌花的表達量在Fl時期最低,之后呈

5、上升趨勢,上升幅度不大。表明可能是在花發(fā)育早期發(fā)揮作用。另外,我們還發(fā)現(xiàn)基因在根、頂芽和葉中的表達都受外源乙烯的誘導。且在M近等基因系材料S52 iffM M)和B52(F F M M)中,B52頂芽和成熟雌花中CsCTRl的表達量明顯高于S52的表達量,我們推測,CsCTRl在這一對近等基因系材料中表達量的差異可能是由于內源乙烯不同而造成。
　　2.利用RT-PCR和R A C E技術,首次成功克隆出黃瓜乙烯信號轉導途發(fā)中ETH

6、YLENE INSENSITIVE2基浪i E I N2)的全長c D N A序列,命名為CsEIN2,其全長4565bp,含有3873bp的ORF,編碼1290個氨基酸。CsEIN2位于6號染色體,含有7個外顯子、6個內含子,在基因組中為單拷貝。與其他物種進行氨基酸序列比對及系統(tǒng)進化樹分析顯示,CsEIN2與其他植物E IN2高度同源,在進化過程中起源于同一祖先,且與甜瓜聚類在一簇。在擬南芥突變株中異源表達可以恢復正常的乙烯信號轉導,

7、說明CSEIN2的確參與乙烯信號轉導。在根、莖、成熟葉片、頂芽、成熟雌花和成熟雄花、幼果中都有表達,說明C s E im呈組成型表達模式,但具有組織差異性。在黃瓜不同花發(fā)育時期,雄花中Cs:EIN2 mRNA的積累量基本沒有變化,雌花中Cv￡/＃2mRNA的積累量呈先上升后下降,但表達量變化不大。另外,我們還發(fā)現(xiàn)基因在根、頂芽和葉中的表達都不受外源乙烯誘導,推測可能在蛋白水平受乙烯調控。在F//近等基因系材料S52 iffM M)和B5

8、2(F F M M)中,S52頂芽和成熟花中CsEIN2的表達量明顯高于B52的表達量。
　　3.利用RT-PCR和R A C E技術,首次成功克隆出黃瓜乙烯信號轉導途徑中ETHYLENE INSENSITIVE3基因的全長 c D N A序列,命名為CsEIN3,其全長2560bp,含有1908bp的ORF,編碼635個氨基酸。CsEIN3位于I號染色體,與基因組比較發(fā)現(xiàn)無內含子,在基因組中為單拷貝。與其他物種進行氨基酸序列比對

9、及系統(tǒng)進化樹分析顯示,CsEIN3與其他植物E IN3/E IL高度同源,在進化過程中起源于同一祖先,且與甜瓜聚類在一簇。在根、莖、成熟葉片、頂芽、成熟雌花和成熟雄花中都有表達,表明呈組成型表達模式,但具有組織差異性。在黃瓜花發(fā)育不同時期,雄花和雌花中CvE/奶 mRNA的積累量都呈增加的趨勢,而且雄花中的表達量一直高于雌花。另外,在近等基因系材料S52(JjMM)和B52(FFM M)中,S52頂芽和成熟花中CsEIN3的表達量明顯高

10、于B52的表達量。
　　4.采用黃瓜品系S52的子葉節(jié)為受體,通過根癌農(nóng)桿菌GV3101介導轉化PCAMBIA2301載體,對黃瓜遺傳轉化體系條件進行優(yōu)化。結果表明,苗態(tài)為子葉剛脫離種殼時誘導率最高,達到100％,每塊外植體再生芽數(shù)可達4.13,且g u s表達率高于其他處理,其中經(jīng)輕傷口處理的外植體遺傳轉化率最高,而傷口太重則不利于轉化。在篩選出最佳苗態(tài)的基礎上研究了不同濃度6-BA和A B A對黃瓜子葉節(jié)離體再生的影響,獲得S

11、52品系最優(yōu)芽誘導培養(yǎng)基為MS+1.5 mg/L6-BA+0.5 mg/L ABA+2.0 mg/L AgNO3。根據(jù)敏感性試驗確定芽誘導和生根誘導選擇壓均為Kan50 mg/L。運用gus瞬時表達法對預培養(yǎng)時間、侵染時間和共培養(yǎng)時間進行優(yōu)化,得出預培養(yǎng)時間為1-2 d,侵染時間20min,共培養(yǎng)3天時轉化效率較高。另外,我們的實驗結果也證明在黃瓜遺傳轉化中進行恢復培養(yǎng)結合合適的篩選劑濃度對黃瓜子葉節(jié)轉化具有促進作用。
　　本研究