黃瓜低霜霉威殘留性相關(guān)基因SDH的克隆及遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、黃瓜是一種極其重要的鮮食性蔬菜，廣泛被人們所喜愛。但是近年來栽培技術(shù)不斷更新、進步，蔬菜的生育期逐漸縮短，且生態(tài)環(huán)境的破壞導(dǎo)致蔬菜病蟲害逐年加劇，病蟲的抗藥性也越來越強，所以絕大部分的蔬菜需要多次噴灑農(nóng)藥以后才能成熟上市，而農(nóng)藥的藥性和持久性也隨之越來越強，黃瓜農(nóng)藥殘留問題日益嚴(yán)重，成為政府、市場和消費者廣為關(guān)注的熱點問題，而且它不僅嚴(yán)重危害到人的健康，也會影響到出口創(chuàng)匯[1]。
　　黃瓜霜霉病是黃瓜植株的主要病害之一，在各種地域

2、及栽培設(shè)施中均能發(fā)生[2-8]，霜霉威屬于氨基甲酸酯類殺菌劑，內(nèi)吸性較強，我國有近80％的農(nóng)民使用霜霉威來防治黃瓜霜霉病。因生產(chǎn)上的大規(guī)模、大劑量使用，霜霉威農(nóng)藥殘留已經(jīng)成為黃瓜生產(chǎn)上的一個不容忽視的問題。
　　琥珀酸脫氫酶(SDH)是將有機物氧化分解成CO2和H2O及ATP合成過程中的關(guān)鍵酶之一。它能夠催化三羧酸循環(huán)(TCA)過程中的琥珀酸氧化生成延胡索酸。延胡索酸作為一種抗氧化劑，擁有捕獲并中和自由基的功能，從而達到祛除自由基

3、，降低對生物體的損害的作用。SDH的另一個重要功能是通過電子呼吸鏈產(chǎn)生ATP，為生物體各種生命活動提供能量，因此SDH的活性對生命體的整個生物代謝過程都有很大的影響。本課題組前期通過Solexa技術(shù)和比較基因組學(xué)的方法對霜霉威脅迫下黃瓜果實差異表達基因進行鑒定，篩選出黃瓜低霜霉威殘留性相關(guān)基因SDH。
　　本研究利用PCR克隆獲得SDH基因全長，并命名為CsSDH。構(gòu)建亞細(xì)胞定位表達載體，并利用農(nóng)桿菌浸潤法注射煙草葉片后激光共聚焦

4、顯微鏡下觀察;分別用熒光定量RT-PCR方法和酶聯(lián)免疫法研究高、低農(nóng)殘品系D9320和D0351中的CsSDH基因在農(nóng)藥霜霉威處理后，不同時間點、不同組織部位的時空表達特征和琥珀酸脫氫酶活性。構(gòu)建了PBI121-CsSDH植物過表達載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，獲得了CsSDH基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，主要研究結(jié)果如下:
　　(1)以黃瓜品種D0351幼嫩葉片為材料，分離并克隆了黃瓜CsSDH基因，該基因全長834 bp，編碼277個氨

5、基酸，氨基酸序列含有2個結(jié)構(gòu)域，在48-152aa具有Fer2保守結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域?qū)儆贔er2超家族，在酶促反應(yīng)和電子傳遞過程中起重要作用。而靠近C-端189-262 aa具有一個Fer417結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域?qū)勹F硫蛋白超家族(HCP-like superfamily)，在氮代謝中發(fā)揮重要作用。系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)黃瓜CsSDH與甜瓜CmSDH關(guān)系最近，同源性為96％，與菜豆同源性為85％，與大豆同源性為84％，與鷹嘴豆同源性為86％，與蒺

6、藜苜蓿同源性為84％，與馬鈴薯和番茄的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，同源性僅為82％。該基因是一個保守的基因。CsSDH基因編碼蛋白是一個不穩(wěn)定親水蛋白，不具有跨膜結(jié)構(gòu)，沒有信號肽及明顯疏水區(qū)域;
　　(2)在霜霉威脅迫下，黃瓜低農(nóng)殘品種D0351中，CsSDH基因在果實受霜霉威脅迫后反應(yīng)迅速，主要在處理前期響應(yīng)表達強烈，琥珀酸脫氫酶活性顯著增加，且該基因表達量顯著高于其在高農(nóng)殘品種D9320中表達量。CsSDH在果、葉中表達量較莖中高，且各組織

7、部位表達量高低順序穩(wěn)定，為葉＞果＞莖。在黃瓜高農(nóng)殘品種D9320中，CsSDH基因表達量在0.5、1、3、12 h呈現(xiàn)上調(diào)表達，6、9h基因表達量與對照組差異不顯著，在48 h出現(xiàn)上調(diào)表達高峰。這與D0351中該基因的表達規(guī)律表現(xiàn)不一致。研究結(jié)果通過對比高、低農(nóng)殘中該基因表達情況分析，發(fā)現(xiàn)該基因與低農(nóng)殘的相關(guān)性，初步確定為低農(nóng)殘相關(guān)基因。
　　(3)構(gòu)建了CsSDH基因過表達載體，命名為PBI121-SDH;并將構(gòu)建成功的植物表達