氨基轉(zhuǎn)移酶基因（eR基因）的克隆及在黃瓜中的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、由假古巴霜霉菌(Pseduoperonospora cubensis)引起的霜霉病是世界范圍內(nèi)的瓜類作物的災(zāi)害性病害。黃瓜(Cucumis stativus L.)上尤為嚴(yán)重，無論是保護(hù)地還是露地條件下栽培的黃瓜，發(fā)病普遍而且危害嚴(yán)重。利用DNA重組技術(shù)可使性狀在種間轉(zhuǎn)移，且受體本身主要性狀不被改變，突破了遠(yuǎn)緣雜交不親合障礙，開辟了植物育種的新途徑。本試驗(yàn)以黃瓜、甜瓜為試材，克隆了兩個(gè)eR基因，H-At2、T-At2，其中H-At2基因

2、為首次在黃瓜中克隆，并得到編碼區(qū)序列。申請了GENBANK號(hào)，分別為EF628204、EF628205。同時(shí)也克隆了黃瓜、甜瓜基因組中的At2基因，記為H’-At2、T’-At2，也申請了GENBANK號(hào)，分別為EF628206、EF628207。將H-At2、T-At2這兩個(gè)基因轉(zhuǎn)化到黃瓜中，期望提高黃瓜對霜霉病的抗性，獲得有育種價(jià)值的黃瓜種質(zhì)資源。 通過提高寄主酶促活性來提高抗病性的基因，被叫做酶促抗性基因(enzymati

3、cresistance)簡稱eR基因。At1、At2是編碼光呼吸乙醛酸循環(huán)過氧化氫酶系中的氨基轉(zhuǎn)移酶的兩個(gè)基因，最近的研究表明將兩個(gè)基因轉(zhuǎn)化到感性甜瓜品系表現(xiàn)出對霜霉病高抗病性。本試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上以黃瓜、甜瓜為試材，采用RT-PCR(reverse transcription polymerasechain reaction)方法從cDNA中克隆了eR基因一氨基轉(zhuǎn)移酶基因(At2)；構(gòu)建了由光合啟動(dòng)子PNZIP調(diào)控的At2基因的植物表達(dá)載

4、體(PPN-At2)和植物通用表達(dá)載體 PPN；利用花粉管通道技術(shù)將其導(dǎo)入黃瓜優(yōu)良自交系中。獲得了轉(zhuǎn)PPN-at2 PCR 陽性植株。主要研究結(jié)果如下： 1.本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)進(jìn)行了氨基轉(zhuǎn)移酶基因(At2基因)的克隆及其表達(dá)載體的構(gòu)建。根據(jù)甜瓜At2基因序列設(shè)計(jì)引物，從抗病黃瓜、甜瓜葉片的總RNA中，利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出H-At2、T-At2編碼區(qū)基因片段，克隆到PGEM-T easy載體中，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)與已知的抗性At2序列具有很

5、高的同源性。 2.構(gòu)建了由PNZIP的啟動(dòng)子調(diào)控的通用植物表達(dá)載體(PPN)及其At2基因的植物表達(dá)載體(PPN-At2)。用ScaⅠ/ScaⅡ從重組質(zhì)粒中切出H-At2、T-At2基因片段，插入到PNZIP的啟動(dòng)子之后，獲得了工程菌株，并命名為PPN-at2。 3.利用花粉管通道技術(shù)對上述基因進(jìn)行了黃瓜的遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。將PPN-At2導(dǎo)入黃瓜優(yōu)良自交系中，在經(jīng)卡那霉素(KN)抗性初步篩選基礎(chǔ)上，對抗性苗進(jìn)行了PCR技術(shù)