茶樹丙氨酸脫羧酶與丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因的分離鑒定.pdf

1、氮素是植物生長發(fā)育過程中需求量最大的礦質(zhì)元素，氮素供應(yīng)不足會嚴(yán)重影響農(nóng)作物的產(chǎn)量。為了保證產(chǎn)量，現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中往往施用大量氮肥。但是大多數(shù)農(nóng)作物對氮肥的利用率非常低，大量氮肥因流失而造成環(huán)境污染。因此借助基因工程手段培育氮高效利用作物品種，成為降低氮肥的施用量、減少環(huán)境污染的根本途徑。
　　茶樹作為葉用作物，其氮素利用率直接影響茶葉產(chǎn)量，選育氮素利用效率高的品種一直是茶樹育種工作者的重要目標(biāo)之一。茶樹的氮素吸收利用率主要取決于

2、其吸收、同化以及運輸分配到收獲器官中的能力。目前茶樹中氮素吸收轉(zhuǎn)運與初步同化相關(guān)基因已經(jīng)被克隆。近年來研究發(fā)現(xiàn)，氮素同化下游途徑中的丙氨酸代謝相關(guān)基因，也在氮素的吸收利用中起重要作用。本研究克隆了2個與茶樹丙氨酸代謝相關(guān)的基因，丙氨酸脫羧酶與丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因，分析了其組織表達特性，并鑒定了相關(guān)功能。主要研究結(jié)果如下:
　　1.根據(jù)茶樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中獲得的基因序列設(shè)計引物，克隆了茶樹CL4912基因，并對其進行生物信息學(xué)分析。結(jié)

3、果表明，CL4912的cDNA全長1716bp，編碼478個氨基酸，推導(dǎo)的蛋白分子量為53.6 kD，理論等電點(pI)為5.83。CL4912為穩(wěn)定的親水性蛋白，不含跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽。
　　2.同源序列搜索與系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示，CL4912蛋白具有絲氨酸脫羧酶功能。將CL4912蛋白基因進行原核表達，并純化蛋白檢測其催化活性。研究結(jié)果顯示，該蛋白分子量約為55kD，CL4912蛋白既可以催化丙氨酸脫羧，又可以催化絲氨酸脫羧，且

4、丙氨酸脫羧的活性為絲氨酸脫羧活性的8～10倍，因此將編碼該蛋白的基因命名為茶樹丙氨酸脫羧酶基因(CsAlaDC)。
　　3.明確了CsAlaDC基因的組織表達特性及其對氮素的響應(yīng)。結(jié)果表明，該基因在茶樹一芽二葉、成熟葉和根中均有表達，但是在根系中的表達量極高，為葉片表達量的數(shù)百倍。氮素處理后，不同茶樹品種的根系中，CsAlaDC基因的表達量，有相似的變化規(guī)律，即在短期(24h)內(nèi)下調(diào)表達，在隨后較長一段時間內(nèi)上調(diào)表達，處理5天后達

5、到響應(yīng)最大值，隨后表現(xiàn)出下調(diào)趨勢;但是該基因?qū)Φ仨憫?yīng)的強弱，隨氮素供應(yīng)水平和品種的不同而存在一定的差異。
　　4.克隆了茶樹丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因（CsAlaAT1），并對其進行生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示，CsAlaAT1的cDNA全長1747 bp，編碼541個氨基酸，推導(dǎo)的蛋白分子量為59.4 kD，理論等電點(pI)為5.82。CsAlaAT1為親水蛋白，不含跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽。通過在線序列搜索，發(fā)現(xiàn)CsAlaAT1蛋白與其他物

6、種AlaAT蛋白有較高的相似性。親緣關(guān)系分析結(jié)果表明，CsAlaAT1與黃瓜AlaAT2親緣關(guān)系最近，推測兩者具有相似的生物學(xué)功能。
　　5.檢測并分析CsAlaAT1基因表達的組織特性及其對氮素的響應(yīng)。結(jié)果顯示，該基因在一芽二葉、成熟葉和根系中均有表達，在根中的表達量高于其他兩個組織。對CsAlaAT1基因表達對氮素的響應(yīng)研究表明成熟葉中CsAlaAT1受氮素誘導(dǎo)上調(diào)表達，高濃度(1mmolL-1 NH4NO3)氮素的誘導(dǎo)效應(yīng)比